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QUÍMICA BIOLÓGICA
TRABAJO DE LABORATORIO Nº 1:
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

DOCENTES: Dante Maugeri, Griselda N. Noé y Valeria Conforte

Introducción:
Descripción de los métodos más utilizados:
1) Espectrofotometría UV:
a) Absorbancia a 280 nm
La mayor parte de las proteínas poseen un pico de absorción máxima a 280 nm. Los
grupos responsables de tal característica son los aminoácidos aromáticos(Tirosina y
Triptofano).
Las proteínas poseen coeficientes de extinción molar (E280nm) que puede variar de
acuerdo a su composición aminoacídica entre 0,4-1,5. Como aproximación se puede
considerar que una unidad de absorbancia se corresponde con una concentración (C)
de 1mg/ml de proteinas:
Abs280nm . E280nm = C, si

E280nm se considera = 1

Abs280nm = 1 mg/ml
Si la solución de proteínas contieneDNA y/o RNA se introduce un error en la
medición, dado que estos absorben a 280 nm.

b)

Absorbancia a 205-210 nm

A dicha longitud de onda absorbe la unión peptídica, por lo tanto es un método más
sensible y no dependiente de los aminoácidos que componen la proteína en estudio.
La limitación de esta técnica esta dada por que la mayoría de los buffers utilizados
también absorben a esa longitud deonda.

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2)

Método de Lowry:

La técnica se basa en la reducción de una mezcla de ácidos que forman el
reactivo cromógeno de Folin-Ciocalteau por la oxidación de los aminoácidos
aromáticos de las proteínas.
Se utiliza cobre como catalizador de la reacción ya que este último forma un
quelato con la estructura peptídica que facilita la transferencia de electrones a la mezcla
cromogénica de ácidos,produciendo una o más especies reducidas las cuales tienen un
característico color azul con una λmáx 745-750 ηm y una λmin a 405 ηm.
Al producirse dicha reacción hay un cambio en el color de la muestra que puede
ser cuantificado determinando la absorbancia a 660nm. Dentro de determinados rangos
de concentración de proteínas existe una relación lineal entre C y la Abs660nm. A
concentraciones altasde proteínas la linealidad se pierde y por lo tanto este método no
será adecuado para determinar la C real.
El rango adecuado es de entre 5 a 100 microgramos de proteína.
Existe una amplia lista de sustancias (como buffers, detergentes, lípidos, etc.)
que interfieren con este ensayo y por lo tanto afectan la determinación de la C real. La
solución a este problema se consigue diluyendo la muestra,y asi la cantidad de
interferente o por precipitación de las proteínas y resuspensión en un buffer sin
interferentes.
3)

Método de Biuret:

El principio de este ensayo es similar al de Lowry, siendo un método más rápido
y menos engorroso. Bajo condiciones alcalinas, sustancias conteniendo dos o más
uniones peptídicas forman un complejo púrpura con sales de cobre. No se utiliza en este
ensayo elreactivo de Folin-Ciocalteau. Tiene muy pocos agentes interferentes (uno de
ellos es el sulfato de amonio). Es un método menos sensible que el de Lowry por lo que
requiere mayor cantidad de muestra.
El rango adecuado usando 1 ml final es de 0,1 a 1 mg de proteínas.

4)

Método de Bradford:

método por unión de colorantes

En condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las proteínaspueden
interaccionar con grupos orgánicos de determinados colorantes para dar lugar a
precipitados con un color característico.
Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de

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color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los
grupos amino de lasproteínas.
Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y también existe una relación
lineal dentro de determinadas concentraciones de proteínas.
Este método es muy rápido y sensible y se puede trabajar en un rango de 20 a 140
microgramos de proteína para el ensayo estándar y de 1 a 50 microgramos para el
microensayo.

Materiales y Métodos:
• Espectrofotómetro y cubetas adecuadas
• Estándar de...