Usos Pcr

AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS A TRAVES DE LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PRESENTADO POR:

RAFAEL MAURICIO SANDOVAL CABRERA
JORGE AUGUSTO COCOMA

PRESENTADO A:

MARIBEB CASTRO

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
LICENCIATURA EN EDUCACIÓN BÁSICA CON ÉNFASIS EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACIÓN AMBIENTAL
GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
IBAGUÉ
2012

LABORATORIO

1. TITULO:Amplificación de ácidos nucleicos a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

2. OBJETIVOS:

* Familiarizarnos con la práctica de laboratorio denominada PCR.
* Reconocer los reactivos para realizar la PCR.
* Diseñar una práctica de PCR de fragmentos de genes funcionales con muestras de ADN.
* Observar los amplicones en geles de agarosa.

3. MARCO TEORICOLA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombre en inglés Polymerase Chain Reaction) permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonucleico). El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos delfragmento a amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que una enzima polimerasa sea capaz de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Una vez completada la reacción la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante técnicas sencillas de separación de fragmentos de DNA. (1)
Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solocabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico.
También ha facilitado el diagnósticode enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológicas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de células cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelación en extremo valiosa, un nuevo avance de laenfermedad.(2)

Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia de nucleótidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de ADN complementarios a una porción de cada una de las dos cadena de la doble hélice. (3)

1. La mezcla de reacción contiene la secuencia de DNAque se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (P1 y P2) que servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucleótidostrifosfato –dATP, dGTP, dCTP y dTTP–.
2. Proceso:
La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o alineación y una de elongación. (FIG 1)

a)Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.
b) Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.
c) Durante la fase de extensión ó elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y laenzima Taq ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión de la cadena complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.

Fig. 1 Pasos básicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)
Reactivos usados para la técnica de PCR (4)...