Vectores y clonado

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VECTORES Y CLONADO

Martín Monte, viernes 27 de Marzo, 2009

Caracterización y estudio de la función de un gen
(Tb podría ser un fragmento de DNA genómico para el estudio de splicing o del promotor de un gen)

1- Obtención del gen de interés mRNA

RT 1ra cadena 2da cadena cDNA
Vector

PCR

Screening Búsqueda Library

Obtención de la secuencia

Caracterización y estudio de lafunción de un gen
Secuenciación

Análisis de la secuencia: Identificación del fragmento secuenciado enfrentándolo a bases de datos de DNA

Caracterización y estudio de la función de un gen
Análisis de la secuencia: Caracterización del fragmento de DNA

ATG

STOP

5’UTR

ORF cDNA

3’UTR

Caracterización y estudio de la función de un gen

Origen library

Utilidad limitada(sonda, transc-traducc in vitro) Generalmente los cDNAs no se expresan cuando están clonados en vectores de libraries Se puede replicar en bacterias

Origen PCR

Utilidad muy limitada (sonda) No se expresan Se debe amplificar y secuenciar cada vez que se necesite más material No se puede replicar en bacterias

Para continuar con el estudio del fragmento de DNA es necesario clonarlo en unvector adecuado

Vectores
• PLASMIDOS: construcciones de DNA derivados de plásmidos naturales. Límite clonado 0.110 Kb • BACTERIOFAGOS: Derivados del genoma de virus que infectan bacterias (fago l ) 8-25 Kb. Pueden ser empacados en fagos nuevamente. • COSMIDOS: Plásmido que contiene secuencias cos del fago l y pueden ser empacados en fagos 35-50 Kb • BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)Derivados plásmido F de E. coli, 75-300 Kb • PAC s es como un BAC, pero deriva del plásmido-P1 . Lim. Clonado 100 Kb • YACs (Yeast artificial Chromosome): cromosoma de levaduras artificial, pretende imitar a un cromosoma, contiene Centrómero y Telómeros . Lim Clonado:100-1000 Kb

plásmido
BAC

YAC

Fago l

Vectores
Clonado en un vector adecuado al estudio que se pretende realizar: • Sistema:bacterias, levaduras, plantas, células de mamífero • Objetivo: • Clonado de fragmentos de DNA para hacer una library


• •

Expresión de cDNA completo, fragmentos, necesidad de fusiones
Análisis de la actividad de un promotor Expresión de la proteína para ver su función



Expresión de la proteína para producirla y purificarla

Vectores
Son largos fragmentos de DNA construidos apartir de plásmidos, o bacteriófagos naturales con la capacidad de replicación

autónoma y que permiten el clonado de fragmentos de DNA

Características: • • • Poseen secuencias que permiten su propagación autónoma (ORI) Poseen una región para insertar el DNA a clonar (Multiple Cloning Site-MCSo polylinker) con sitios únicos para varias enzimas de restricción. Marcadores de selección:permiten seleccionar exclusivamente las células que contiene el vector.

PLASMIDOS: Molécula circular de DNA doble cadena extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS

• Resistencia a antibióticos
• Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas) • Producción de toxinas (ej E.coli, enterotoxinas) • Producción debacteriocinas (colicinas, subtilicinas) • Inducción de tumores (plantas) • Sistemas de Restricción-modificación • Producción de antibióticos (ej Streptomyces) • Resistencia a metales pesados

R6 Tn3 Ampr pSC101 Stanley Cohen Tetr

Ori pMB9 Mary Betlach

ColE1 Construido por Ray Rodriguez and Herbert Boyer

PLASMIDOS: Sitio para clonado

Gen de resistencia

Origen de replicación PLASMIDOS: marcadores de selección

Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :

• Marcadores de resistencia a antibióticos
Ej: Ampicilina , Kanamicina, Tetraciclina , Zeocina, Neomicina, Puromicina • Marcadores de auxotrofía (permiten síntesis de un componente esencial para el crecimiento celular) Ej: aminoácidos

PLASMIDOS: marcadores de selección

Ampicilina: agente...
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