Vectores y clonado
Martín Monte, viernes 27 de Marzo, 2009
Caracterización y estudio de la función de un gen
(Tb podría ser un fragmento de DNA genómico para el estudio de splicing o del promotor de un gen)
1- Obtención del gen de interés mRNA
RT 1ra cadena 2da cadena cDNA
Vector
PCR
Screening Búsqueda Library
Obtención de la secuencia
Caracterización y estudio de lafunción de un gen
Secuenciación
Análisis de la secuencia: Identificación del fragmento secuenciado enfrentándolo a bases de datos de DNA
Caracterización y estudio de la función de un gen
Análisis de la secuencia: Caracterización del fragmento de DNA
ATG
STOP
5’UTR
ORF cDNA
3’UTR
Caracterización y estudio de la función de un gen
Origen library
Utilidad limitada(sonda, transc-traducc in vitro) Generalmente los cDNAs no se expresan cuando están clonados en vectores de libraries Se puede replicar en bacterias
Origen PCR
Utilidad muy limitada (sonda) No se expresan Se debe amplificar y secuenciar cada vez que se necesite más material No se puede replicar en bacterias
Para continuar con el estudio del fragmento de DNA es necesario clonarlo en unvector adecuado
Vectores
• PLASMIDOS: construcciones de DNA derivados de plásmidos naturales. Límite clonado 0.110 Kb • BACTERIOFAGOS: Derivados del genoma de virus que infectan bacterias (fago l ) 8-25 Kb. Pueden ser empacados en fagos nuevamente. • COSMIDOS: Plásmido que contiene secuencias cos del fago l y pueden ser empacados en fagos 35-50 Kb • BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)Derivados plásmido F de E. coli, 75-300 Kb • PAC s es como un BAC, pero deriva del plásmido-P1 . Lim. Clonado 100 Kb • YACs (Yeast artificial Chromosome): cromosoma de levaduras artificial, pretende imitar a un cromosoma, contiene Centrómero y Telómeros . Lim Clonado:100-1000 Kb
plásmido
BAC
YAC
Fago l
Vectores
Clonado en un vector adecuado al estudio que se pretende realizar: • Sistema:bacterias, levaduras, plantas, células de mamífero • Objetivo: • Clonado de fragmentos de DNA para hacer una library
•
• •
Expresión de cDNA completo, fragmentos, necesidad de fusiones
Análisis de la actividad de un promotor Expresión de la proteína para ver su función
•
Expresión de la proteína para producirla y purificarla
Vectores
Son largos fragmentos de DNA construidos apartir de plásmidos, o bacteriófagos naturales con la capacidad de replicación
autónoma y que permiten el clonado de fragmentos de DNA
Características: • • • Poseen secuencias que permiten su propagación autónoma (ORI) Poseen una región para insertar el DNA a clonar (Multiple Cloning Site-MCSo polylinker) con sitios únicos para varias enzimas de restricción. Marcadores de selección:permiten seleccionar exclusivamente las células que contiene el vector.
PLASMIDOS: Molécula circular de DNA doble cadena extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS
• Resistencia a antibióticos
• Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas) • Producción de toxinas (ej E.coli, enterotoxinas) • Producción debacteriocinas (colicinas, subtilicinas) • Inducción de tumores (plantas) • Sistemas de Restricción-modificación • Producción de antibióticos (ej Streptomyces) • Resistencia a metales pesados
R6 Tn3 Ampr pSC101 Stanley Cohen Tetr
Ori pMB9 Mary Betlach
ColE1 Construido por Ray Rodriguez and Herbert Boyer
PLASMIDOS: Sitio para clonado
Gen de resistencia
Origen de replicaciónPLASMIDOS: marcadores de selección
Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :
• Marcadores de resistencia a antibióticos
Ej: Ampicilina , Kanamicina, Tetraciclina , Zeocina, Neomicina, Puromicina • Marcadores de auxotrofía (permiten síntesis de un componente esencial para el crecimiento celular) Ej: aminoácidos
PLASMIDOS: marcadores de selección
Ampicilina: agente...
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