Yarelis Flores Malave 11 De Enero De 2015

Yarelis Flores Malavé 11 de enero de 2015
Y00 47 3587
Seminario I - Dra. Sonia Robles

Artículo #1: Gene Replacement in Mycobacterium chelonae: Application to the Construction of PorinKnock-Out Mutants

M. chelonae y M. abscessus son bacterias RGM, “Rapidly growing non-tuberculous mycobacteria” patógenos oportunistas que causan una amplio rango de enfermedades en el humano. Actualmentese conoce la secuencia genómica de M. abscessus, el genoma de M. chelonae está aún en proceso de ser revelado. Se espera que al poder comparar el genoma de ambos patógenos se abra la puerta para nuevasinvestigaciones e interrogantes, sin embargo es necesario encontrar sistemas de mutagénesis y expresión genómica que permitan acivar y desactivar genes en estos microorganismos con éxito. A la fechano se ha encontrado un sistema completamente efectivo de mutagénesis para M. chelonae, este estudio pretende facilitar futuras investigaciones dada la falta de métodos genéticos efectivos. Se estarántrabajando varios métodos de reemplazo alelico, el primero es el sistema sensible a la tempretarura SacB, el método micobacteriófago termosensible y el método basado en recombinasa.
Para poner enpráctica cada una de las técnicas se utilizó un cultivo de E.coli como sepa para el clonaje, cultivos de M. chelonae y M. abscessus en caldo Middlebrook 7H9-OADC. En primer método, Ts-SacB se amplificócon PCR la región del gen MCH_4689c de M. chelonae así como MCH_4690c y MCH_4691c. Los alelos interrumpidos de MCH_4690c y MCH_4691c se obtuvieron mediante la inserción de los cassetes de resistenciakan y zeo al sitio SgfI de los genes. Los seis alelos fueron clonados en el XbaI-cut pPR27-xylE, estos son pPR27-4689-KX, pPR27-4689-ZX, pPR27-4690- KX, pPR27-4690-ZX, pPR27-4691-KX y pPR27-4691-ZXplásmidos usados para reemplazo alelico. El pPR27-xylE que carga los plásmidos interrumpidos fue electroporado en M. chelonae y encubado en medio que contienen Kan o Zeo a 30OC. Las colinias...