PCR – REACCIÓ EN CADENA DE LA POLIMERASA

PCR – REACCIÓ EN CADENA DE LA POLIMERASA
La reacció en cadena de la polimerasa consisteix a l’amplificació mitjançant la polimerització in vitro d’una seqüència específica de DNA, una seqüència que volem tenir repetida moltes vegades.
Per a aquesta reacció és necessari:
DNA curt motlle monohèbric (DNA a copiar)
DNA curt que s’enganxa al DNA motlle i sobre el qual s’aniran afegint nucleòtidsmitjançant la reacció de polimerització, copiant la cadena d’adalt. També anomenat iniciador, primer, encebador, oligonucleòtid...)
Es col·loca a l’extrem 3’OH mirant cap a la regió a amplificar.
Sempre se’n posen dos, un per a cada hebra del DNA motlle.
Nucleòtids trifosfats
Polimerasa i els seus cofactors
La DNA polimerasa allarga una cadena de DNA unida a una cadena de DNA motlle afeginta la cadena que està creixen la base complementària corresponent.
Tampó
Buffer: tampó on té lloc la reacció, en ell hi ha ions que actuen com a cofactors d’enzims.

Etapes de la polimerització
1. Desnaturalització del DNA motlle, a aproximadament 94ºC, per tal d’assegurar que es troba en forma de monohebra.
2. Hibridació (o anneling) del DNA iniciador amb el motlle, a uns 40-60ºC
Es baixala temperatura per tal que els encebadors reconeguin el lloc on s’han d’enganxar i s’hi enganxin.
3. Extensió (o síntesi) a la temperatura òptima per a la polimerasa (uns 72ºC)
Es van afegint els nucleòtids en direcció 5’  3’. Les cadenes curtes que volem amplificar creixen exponencialment, mentre que el nombre de cadenes llargues creix linealment.
Tot això es fa en forma de cicle. No se solensuperar els 30 cicles perquè aleshores ja no té lloc un creixement exponencial per diversos motius.
Un cop finalitzat el PCR es farà una electroforesi d’agarosa o un HPLC d’intercanvi iònic per detectar i visualitzar el DNA.
Per tal d’automatitzar la tècnica es va buscar una DNA polimerasa que fos termoestable i pogués passar per l’etapa de desnaturalització, per tal de no haver d’anar-larenovant. També es van inventar els termocicladors, que permeten baixar i pujar la temperatura de manera molt ràpida.

Optimització de la tècnica
Tot i que són variables que van en sentit contrari, es busca sempre uns valors màxims d’especificitat (que només s’amplifiqui el fragment d’interès) i de rendiment (que la reacció funcioni exponencialment durant tot el procés). Petites quantitats sónsuficients per portar a terme l’amplificació
COMPONENTS DE LA REACCIÓ
DNA motlle: no afecta que el DNA no sigui pur (amb proteïnes) però si que afecta que tingui nicks, és a dir, discontinuïtats. És molt important també que no hi hagi agents que els produeixin (com ara els fenols). Això afecta el rendiment.
Nucleòtids: si el nombre de nucleòtids és molt exagerat pot produir errors perquè a lapolimerasa li costa més distingir-los, és a dir, perd especificitat.
Polimerasa: de bona qualitat, segons la seva termoestabilitat.
Disseny dels primers: és necessari que no presentin una estructura secundària estable. S’ha de tenir en compte la seva Tm, ja que si treballes per sobre d’aquesta hi ha perill que el primer no estigui enganxat al DNA. El magnesi estabilitza aquestes unions, perquè puja elvalor de la Tm, però també és perillós perquè estabilitza unions no desitjades i fa perdre especificitat. És molt important també que els primers no presentin complementarietat interna ni hi hagi perill de dimerització. Si els primers són complementaris en l’extrem 5’, la DNA polimerasa se situarà en l’extrem 3’ i no tindrà res a copiar. Baixarà el rendiment perquè els primers estaran units entreells en comptes d’estar units al DNA motlle. Per altra banda, si els primers són complementaris per l’extrem 3’OH, quan la DNA polimerasa s’hi situï copiarà l’altre primer, obtenint-se un DNA producte dels dos, de manera que s’inutilitzarà directament el PCR, ja que el DNA obtingut (i no desitjat) s’anirà amplificant.

Tampó: si hi ha molt Mg, baixarà l’especificitat, i si n’hi ha molt moc,...