t ransfornacion genetica

Práctica 2

CLONAJE DE GENES EN PLÁSMIDOS BACTERIANOS: Transformación de células competentes de Escherichia coli.

Introducción
Para el clonaje y amplificación del plásmido recombinante preparado en la práctica anterior es necesario introducirlo en una bacteria. Al proceso de incorporación de un DNA aislado de forma estable por una bacteria se denomina “transformación”. Salvo algunasexcepciones, las bacterias son impermeables a la entrada de ácidos nucleicos exógenos en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, disponemos de métodos químicos y físicos que facilitan la entrada del DNA en la bacteria.

Todos los métodos químicos de transformación que se utilizan actualmente derivan de la observación de Mandel y Higa (1970, J. Mol. Biol. 53, 159-162) según la cual lasbacterias tratadas en frío con una disolución de CaCl2, y a continuación sometidas a un choque térmico a 37ºC o 42ºC, se hacen “competentes” y permiten la entrada del DNA del fago . Este método se extrapoló posteriormente a DNA de plásmidos (Cohen et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114). Los métodos actualmente en uso son variaciones del original, encaminadas a optimizar laeficiencia de transformación de cada cepa bacteriana, que suele oscilar entre 106 a 109 transformantes por g de DNA plasmídico. A pesar de las mejoras metodológicas conseguidas, aún desconocemos el mecanismo molecular por el que las células se hacen “competentes” a la entrada de DNA exógeno. Por otra parte, de entre los métodos físicos de transformación de bacterias podemos destacar la “electroporación”.Consiste en exponer las células de E. coli a una descarga eléctrica, que induce la formación transitoria de poros en las membranas por donde penetran las moléculas de DNA.

Los plásmidos que estamos usando en estas prácticas de clonaje tienen el gen de resistencia a ampicilina (bla). Este gen codifica una -lactamasa que hidroliza el anillo -lactámico de la ampicilina, inactivándola. Laampicilina es una aminopenicilina con actividad antimicrobiana de amplio espectro. Inhibe la síntesis del péptidoglicano, constituyente de la pared bacteriana, en células en fase activa de crecimiento. Las bacterias que contienen este tipo de plásmidos se pueden seleccionar creciéndolas en presencia de ampicilina. Obviamente, las bacterias que no han incorporado el plásmido no crecerán en este mediode cultivo.

Para diferenciar las bacterias transformantes que han incorporado el plásmido recombinante de las que han incorporado el plásmido sin inserto se pueden usar varios métodos. Uno de los más frecuentes es el de la complementación del fragmento  de la -galactosidasa. Este método requiere que el vector usado contenga el sitio de policlonaje dentro de la región codificante delfragmento (como el plásmido pBluescript pero no así el plásmido pRSET-T7, ambos usados en la práctica anterior) y la bacteria huesped exprese el otro fragmento de la -galactosidasa necesario para la complementación (lacZM15; presente normalmente en el profago 80 o en F´). En los plásmidos recombinantes, la incorporación del inserto inactiva el fragmento  de forma que las bacterias que contienenestos plásmidos carecen de actividad -galactosidasa, originando colonias blancas en un medio de cultivo que contiene el sustrato incoloro X-gal. Las bacterias transformadas con plásmidos sin inserto aparecen como colonias azules en este medio. La identificación de transformantes con plásmidos recombinantes también se puede hacer por hibridación in situ. Las colonias bacterianas se transfieren afiltros de nitrocelulosa, se lisan y el DNA liberado y desnaturalizado se híbrida con una sonda radiactiva específica del inserto. La posición de los clones recombinantes aparecerán como manchas radiactivas en la autorradiografía.


Objetivos
Obtención de clones bacterianos conteniendo el plásmido recombinante pRSET-cDNA del eIF4E de Drosophila melanogaster (construido en la Práctica 1)....