Bioquimica

PRACTICA N0 1

FOTOCOLORIMETRÍA

I.- INTRODUCCION

La colorimetría es una de las técnicas más usadas en Bioquímica cuando se requiere determinar la concentración de un compuesto o grupo de compuestos que forman parte de una solución coloreada, ya sea naturalmente o hecha así mediante reacciones químicas específicas.

Si un rayo de luz monocromática, de intensidad inicial Io pasa através de una solución, parte de la luz es absorbida, de manera que la intensidad de luz transmitida It es menor que Io.

La relación entre It e Io depende de la longitud del medio absorbente, I; y de la concentración de la solución, c.

Solución absorbente
concentración o

Rayo RayoIncidente Emergente
Luz
Monocromática
Intensidad Io Intensidad It

Espesor de la
solución

Fig. 1: Absorción de la luz por una solución

Estos factores se hallan relacionados en la ley de LAMBER y BEER que se expresa en la siguiente fórmula:

Log (Io/It) =E.c.l.

DONDE:

• Io = Intensidad de luz incidente
• It = Intensidad de luz transmitida
• E = Coeficiente de extinción (contante que depende de la longitud de onda y del soluto)
• l = Distancia que recorre la luz a través de la solución
• C = Concentración de la solución.

En esta fórmula log (Io/It) se conoce como DENSIDAD ÓPTICA (D.O.) o ABSORBANCIA, lacual es directamente proporcional a la concentración de la solución e inversamente proporcional a la intensidad de la luz transmitida.

La cantidad de la luz absorbida por una solución puede ser medida por los FOTOCOLORIMETROS, aparatos que funcionan a base de filtros, y los ESPECTROFOTÓMETROS que utilizan prismas o redes de difracción que dispersan la luz, formando un espectro del cual seelige la longitud de onda o la banda.

Un espectrofotómetro tiene dos aplicaciones importantes, una de ellas es para medir la absorbancia o transmitancia en una determinación cuantitativa basada en la ley de BEER. Otras es para medir los espectros de absorción se sustancias coloridas. Como cada sustancia colorida tiene su propio espectro, los espectros son importantes para la identificacióncualitativa de sustancias y para elegir una longitud de onda adecuada en una determinación espectrofotométrica cuantitativa.

Para calcular la concentración de una solución se puede recurrir a dos procedimientos:

• Factor de calibración
• Curva de calibración o curva estándar

1.- FACTOR DE CALIBRACION (FC).- Es la cantidad en peso de una sustancia que corresponde auna unidad de lectura en el fotocolorímetro o espectrofotómetro. Se halla dividiendo la concentración de muestras estándar (solución de composición química igual a la muestra problema, y de concentración conocida) entre su D.O. Para mayor exactitud se obtienen varios FC y se trabaja con el promedio. Esta división debe ser un valor aproximadamente igual para cada estándar, puesto que expresa laproporcionalidad entre D.O. y concentración.

2.- CURVA ESTÁNDAR.- Este método consiste en preparar soluciones estándar de diferente concentración y construir un gráfico en un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas del estándar en la ordenada y la concentración (en g%, mg% o moles/l, etc) en la abcisa. La concentración de la muestra problema se obtendrá ploteando su lecturaen el gráfico y en el punto de intersección se trazará una perpendicular al eje de las abcisas donde se leerá su concentración.

II.- OBJETIVOS

1. Obtener el espectro de absorción de una sustancia
2. Preparar una curva de calibración para una sustancia coloreada
3. Determinar la concentración de una muestra problema mediante factor de calibración y curva de...