BIOQUIMICA

BIOQUIMICA.

Practica N° 2
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA α–AMILASA

OBJETIVO:
DETERMINAR EL EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA
Α–AMILASA (PTIALINA).

FECHA:
30/06/14
INTRODUCCIÓN
La amilasa, denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, seproduce principalmente en las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene un pH de 7. Cuando uno de estas glándulas se inflama aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautizó en un principio con el nombre de diastasa.
La a-amilasa es una enzimaproteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces,uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos. 
Para medir la actividad enzimática de la a-amilasa, se utilizará un test colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contará con una solución de iodo/ioduro de potasio (I2/IK), ya que el almidónen presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la a-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I2/IK ya no dará una coloración azul.
Por lo tanto,en este TP mediremos la desaparición de sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan las distintas condiciones en que actúa la enzima (pH, temperatura, concentración de NaCl), así como los efectos que pueden causar diferentes pre tratamientos (proteinasa, calor).

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Preparación de lasaliva diluida: Tomar 2 mL. de saliva en un tubo de ensaye, y transferirlos a un vaso de precipitados con 25 mL. de agua destilada. Mezclar perfectamente. Una vez diluida se utilizara lo más pronto posible.

2. Agregar a 3 tubos de ensaye 5 mL. de solución de almidón, a cada uno colocarlo en una temperatura diferente; durante 5 minutos.

a) 0°C b) 37°C c) 93°C

3. Agregar a tres tubos de ensaye 3mL. de saliva diluida (punto 1) y colocarlos en cada una de las temperaturas a), b) y c) durante 5 minutos.

4. Después de transcurrido el tiempo en cada una de las diferentes temperaturas, vacié el contenido de cada uno de los tres tubos con la solución de almidón, en cada uno de los tubos con saliva diluida.

NOTA: Los tres tubos resultantes deben permanecer en el baño de su temperaturacorrespondiente durante el resto del experimento.

5. En el momento de la mezcla, tomar inmediatamente 3 gotas de cada una de los tubos (a, b y c), utilizando tres pipetas diferentes, colocarlas en la placa y agregar 2 gotas de lugol, observando y anotando la coloración en cada una de las diferentes temperaturas.

6. Estas determinaciones se llevaran a cabo cada a los tiempos 0, 3, 6, 9, 14 y 19minutos.

RESULTADOS
TEMPERATURA
TIEMPO ( MINUTOS )

0

3
6
9
14
19
0°C.
positivo
positivo
positivo
positivo
positivo
Positivo
37°C.
positivo
positivo
positivo
positivo
positivo
Positivo
93°C.
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Negativo


DISCUSIÓN
Para empezar, se ha de aclarar que las diluciones óptimas para salivas de diferentes personas son distintas porque las características y...