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3. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
3.1 FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados través de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienencondicionadas por la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases. Se lleva a cabo una cromatografía líquida en fase normal cuando la fase estacionaria es relativamente polar y la fase móvil es relativamente apolar. Se realiza una cromatografía en fase inversa cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y la fase móvil es relativamente polar. Hay cuatro tipos básicos decromatografía en los que la fase móvil es un líquido:-Cromatografía de reparto, para especies poco polares pero no iónicas de masa molecular < 10
4 g/mol.-Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido, para especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular < 10
4 g/mol.-Cromatografía de intercambio iónico, para especies iónicas de masa molecular < 10
4g/mol.-Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en geles, para solutos con masa molecular >10
4 g/mol. La elución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase móvil a través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porción de muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempot0), los componentes se distribuyen por sí mismos entre las dos fases según la naturaleza química de éstos con respecto a las fases móvil y estacionaria. Adicciones posteriores del disolvente llevan a las moléculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una tiempo determinado (tx)
14Columna cromatografía: La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fracción detiempo que ha necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad será pequeña para solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y será grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase móvil. El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma en una gráfica en función del tiempo, un cromatograma, que constade una serie de picos simétricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posición en el eje) como cuantitativamente (área bajo los picos) los componentes de la muestra. La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del área del pico de un analito con el de uno o más estándares. Ambos parámetros varían linealmente con laconcentración. La cromatografía cualitativa se basa en la comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de retención) con cromatogramas estándares. Ejemplo de cromatograma con un detector de Absorbencia:
15La efectividad de la columna cromatografía para la separación de solutos depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia máxima para lacromatografía líquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamaño de la partícula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase móvil o se incrementa la temperatura. En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con diámetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyaspartículas de la fase estacionaria no superaban las150-200 µm de diámetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso así, los tiempos de separación eran largos, podían llevar varias horas. La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid Chromatografy) es el método más sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria...