CROMATOGRAFIA

TÉCNICAS CROMATOGRAFICAS

INTRODUCCIÓN:

Uno de los objetivos de la Bioquímica es el de separar compuestos químicos para su identificación y caracterización. Para ello se desarrollaron numerosas técnicas que se basan en diferencias físico-químicas de los compuestos, como masa, carga, solubilidad, afinidad, etc. Las técnicas más utilizadas son: diálisis, electroforesis, cromatografía,precipitación, centrifugación y ultrafiltración. Todas son aplicables a la purificación tanto de proteínas como de péptidos, aminoácidos, ácidos grasos, lípidos, hidratos de carbono, nucléotidos y ácidos nucleicos.
La cromatografía es una de las técnicas más usadas. Fue desarrollada por primera vez en el siglo XIX por un botánico ruso, con el objeto de separar los pigmentos de las plantas, de allísu nombre de “croma” (color).
En la cromatografía la separación de compuestos de una mezcla se produce debido a que dichos solutos presentan diferentes propiedades que permiten que varíen en su grado de distribución entre una fase móvil o migrante y una fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser una matriz sólida o un líquido o una mezcla de un sólido y un líquido, mientras que la fasemóvil puede ser de naturaleza líquida (cromatografía líquida) o de naturaleza gaseosa (cromatografía gaseosa).
Se entiende por:
SOLUTO: compuesto químico a separar que se encuentra en una muestra.
SORBENTE: fase estacionaria por la que fluye la fase móvil.
SOLVENTE: fase móvil que permite que el soluto migre a través de la fase estacionaria.
En un sistema de solvente y faseestacionaria dado, la distribución del soluto entre las dos fases es una propiedad exclusiva del soluto y difiere de un compuesto a otro.
Cuando un solvente o fase móvil pasa a través de la fase estacionaria, aquellos solutos que tengan mayor afinidad por la fase estacionaria van a ser más retardados que aquellos que tengan menos afinidad y así se producirá la separación de los diferentes solutos. Sudistribución, entre las dos fases de un cromatograma, se puede expresar por el coeficiente de distribución, que por convención es K.

Concentración del soluto en la fase móvil
K = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ _____________________________________________________________
Concentración del soluto en la fase estacionaria

Un valor de K de 0,2 indica que la fase estacionaria contiene cinco veces mássoluto que la fase móvil.
La distribución de los solutos también se puede expresar en términos del coeficiente de distribución efectivo B, que indica la relación entre la cantidad total de soluto en cada fase.

Cantidad total de soluto en la fase móvil
B = _______________________________________________________
Cantidad total de soluto en fase estacionaria

Según la/s sustancia/s aestudiar, las corridas cromatográficas pueden realizarse en papel, en columnas o en placas.
La eficiencia o resolución de una cromatografía en columna, dependiendo del tipo de interacción, puede estar en relación directa con el largo de la columna y en relación inversa con el diámetro de la misma y con el tamaño de las partículas de empaquetamiento. En la cromatografía en placa, la resolución esinversamente proporcional al tamaño de las partículas adheridas al soporte.

Adsorción y Partición
La distribución de solutos entre la fase móvil y la fase estacionaria puede involucrar mayoritariamente procesos de adsorción o de partición, dependiendo de la naturaleza del soluto y del tipo de fase estacionaria utilizada.
En la partición, el soluto se encuentra en equilibrio entre dos líquidosinmiscibles (el solvente y el líquido de la fase estacionaria) y su distribución depende de su solubilidad en los mismos. Los solutos que poseen mayor solubilidad en el solvente migrarán mas rápidamente que los que tienen mayor solubilidad en la fase estacionaria. Todos los compuestos con diferente coeficiente de partición pueden ser separados por técnicas cromatográficas basadas en la partición. La...