Cromatografia


Curso de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

La Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica.  El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entrelas sustancias analizadas y la columna cromatográfica. Los sofisticados sistemas de integración proporcionan resultados de forma rápida y relativamente sencilla.
Existen varios tipos de cromatografía los cuales son: Cromatografía de Partición, Cromatografía de Adsorción, Cromatografía Iónica y Cromatografía de Exclusión.
El pico cromatográfico representa una Gaussiana, que es unadistribución de las moléculas que eluyen a lo largo del tiempo. La cuantificación del pico conlleva la evaluación del número de moléculas de cada soluto (cada pico) y, por tanto, la cantidad o concentración de la misma. El análisis cuantitativo se basa en la comparación de la altura, o el área, del pico del analito con la de uno o más patrones inyectados bajo las mismas condiciones cromatográficas.Siempre y cuando la resolución (Rs) sea adecuada, el área del pico es el parámetro cuantitativo fundamental. Ésta se mide, bien triangulando el pico, como se comentó en la Práctica del cálculo de la eficiencia o mediante un sistema de integración digital electrónico en línea con un ordenador.
En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Técnicas del Laborario Moderno más importantes comoherramienta analítica para separar y detectar compuestos químicos. Como en todas las técnicas analíticas, los pequeños problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun con la evolución de los cromatografos líquidos en la era de la computadora, hay aun problemas que ésta no puede resolver.
Hasta los Solventes para HPLC, tods filtradoscuidadosamente en la fábrica, pueden acumular partículas en suspención que pueden ser perjudical a los componentes del sistema HPLC. Estas partículas en suspención pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposición al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depósito para solvente, la exposición a partículates del aire durante el almacenamiento del solvente en el depósito delsolvente, la degradación lenta del recipiente solvente, o de condensación y polimerización del solvente. Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.Normalización de área con factor de respuesta
Cuando se dispone de los patrones, éstos se pueden analizar en las mismas condiciones, con objeto de calcular los factores de corrección (= factores de respuesta), f. Una substancia (puede ser un analito de la muestra) se elige como patrón y a su factor de respuesta, fp, se le da un valor arbitrario de 100. El cálculo del factor de respuesta se realizaexperimentalmente de la siguiente forma.
Calibración indirecta, relativa o método del patrón interno
En este método, el patrón elegido no puede ser un analito de la muestra. Este patrón se añade a la muestra a analizar en una concentración conocida; de ahí el nombre de patrón interno. Este patrón interno debe cumplir una serie de requisitos: eluir cerca de los picos de interés, estarresuelto de ellos, ser de naturaleza química similar a los analitos de interés y no reaccionar con ellos y debe existir en estado puro.
Método de adición de patrón externo
En este método también se añade un patrón a la muestra problema, pero la naturaleza química del patrón es la misma que la del analito de interés. Se requiere una alta reproducibilidad en el volumen de muestra inyectada....