Espectrofotometría y Curvas de calibración

TP Nº1 – Espectrofotometría y curvas de calibración
Peña, Sara M.; Viegas, M. Celeste.

Química Biológica
T.P. Nº1: Espectrofotometría y curvas de calibración
Objetivos
• Conocer y comparar distintos métodos para el dosaje de proteínas.
• Aprender a diseñar curvas de calibración y confeccionar los protocolos correspondientes.
• Hallar la concentración de una muestra incógnita a partir delos parámetros matemáticos de la
recta graficada.
• Conocer la importancia de contar con una curva de calibración cuando se necesite vincular una
medición experimental – tal como la absorbancia – con una determinada magnitud, como por
ejemplo, la concentración de un dado compuesto.

Metodología
Método de Bradford
Materiales:
Erlenmeyer (50ml), pipeta (2ml), micropipetas (p1000, p200,p100, p20), tubos eppendorf, tubos
de hemólisis, perita. Espectrofotómetro utilizado: J1 (5)
Reactivos:
• Solución patrón: Seroalbúmina bovina (BSA) en concentración 0,5mg/ml
• Reactivo de Bradford (modificado): 40 mg de Coomassi brilliant blue G 250 + 50ml de etanol
+ 100ml de ácido fosfórico 85%, y llevar a 1litro con agua destilada.
Preparamos por duplicado 7 tubos de hemólisis como semuestra a continuación:
Tubos
Proteínas (µg)
Patrón (µl)
Mtra incógnita (µl)
H2O dest. (µl)
Reactivo de Bradford (ml)

Blanco
100
2,0

1
5
10
90
2,0

2
10
20
80
2,0

3
15
30
70
2,0

4
20
40
60
2,0

5
25
50
50
2,0

M3
¿?

M4
¿?

100
2,0

100
2,0

Tabla 1: Contenido de cada uno de los tubos en el método de Bradford.

Tuvimos la precaución de colocarprimero en el tubo los 2 ml del reactivo de Bradford, ya que el
mismo da interferencia con detergentes (se observaría un cambio de color que no corresponde a la
reacción con las proteínas).
Se agitaron los tubos y luego de esperar dos minutos se midió su absorbancia mediante un
espectrofotómetro, colocado a 595 nm.
Se procedió a medir desde el blanco a la solución más concentrada para evitarvariaciones
importantes en la concentración de la solución subsiguiente. Antes de medir las muestras incógnitas
se lavó la cuba con etanol y luego agua destilada.
Con los datos obtenidos se pudo realizar una curva de calibración.

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TP Nº1 – Espectrofotometría y curvas de calibración
Peña, Sara M.; Viegas, M. Celeste.
Método de Lowry
Materiales:
Vasos de precipitados (50ml), pipeta(2ml), micropipetas (p1000, p200), tubos eppendorf, tubos
de hemólisis, perita. Espectrofotómetro utilizado: J2 (4).
Reactivos:
•
Solución patrón: Seroalbúmina bovina (BSA) en concentración 0,5 mg/ml•
Reactivo de Folin – Ciocalteau: mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato.
•
Solución alcalina de cobre, preparada mezclando las soluciones A, B y C en relación
0,1:0,1:10. Se realiza primeroA+B, después agregando C.
A)
Solución de tartrato de sodio y potasio al 2%
B)
Solución de sulfato cúprico pentahidratado al 1%
C)
Solución de carbonato de sodio al 2% en hidróxido de sodio 0,1N.
Preparamos por duplicado 8 tubos de hemólisis siguiendo el protocolo a continuación:
Tubos
Proteínas (µg)
Patrón (µl)
Mtra incógnita (µl)
H2O dest. (µl)
Solución alcalina (ml)

Blanco
4002.0

1
25
50
350
2.0

2
50
100
300
2.0

3
75
150
250
2.0

4
100
200
200
2.0

5
125
250
150
2.0

6
20
40
360
2.0

M3
X
400
2.0

200

200

Mezclamos vigorosamente y dejamos reposar 10 min a temperatura ambiente
Reactivo de Folin (µl)

200

200

200

200

200

200

Mezclamos inmediatamente y dejamos reposar 30 min a temperatura ambienteTabla 2: Protocolo correspondiente al método de Lowry.

Luego se midió la absorbancia a 660 nm. El tubo 6 fue parte de las mediciones para facilitar
la comparación entre este método y el de Bradford, pero originalmente la práctica estaba en el rango
de 25 a 125 µg.

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Resultados
Método de Bradford...