Lab 1 Espectrofotometria Tec 2010

UNIVERSIDAD MAYOR
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA
BIOQUIMICA

PRACTICO N°1:
ESPECTROFOTOMETRIA

1.- INTRODUCCIÓN
Utilizando términos quizás excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometría de
absorción, como la medida de la atenuación que el material a estudiar (muestra) efectúa sobre una
radiación incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, lasmedidas se realizan
dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en
dos amplias zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la
radiación ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por
encima de los 800 nm.

La energía de una onda electromagnética está dada por laecuación: E = hν, donde h es la constante
de Planck y v es el número de onda (el recíproco de la longitud de onda λ).
La energía de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones π y electrones no enlazantes desde
su estado basal a un nivel energético mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la
molécula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente.Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en moléculas conjugadas (moléculas que
poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugación aumenta la longitud de
onda de la absorción al disminuir la diferencia energética entre el estado basal y el estado excitado,
de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto
con un alto número deenlaces conjugados, como el β-caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de
enlaces conjugados que permite la absorción de luz se denomina cromóforo.
Si una luz blanca pasa a través de una solución que contiene compuestos que actúan como
cromóforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la
solución se debe a la luz transmitida.
La absorción de luz por partede una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser
utilizada para su identificación y cuantificación, ya que un compuesto determinado tiene un
espectro de absorción característico, por lo tanto la comparación del espectro de este compuesto
puro con los espectros de compuestos conocidos permitirá su identificación.

Autor: Maribel Arnes S

Leyes de la absorción de energíaradiante
Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es
absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables capaces
de afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el
rayo luminoso recorre a través de la solución.
La Ley de Lambert - Beer establece que la absorciónes proporcional al número de moléculas de la
sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión
matemática para esta ley es:
A=εlc
Donde ε es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida), que es un valor
constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ. Cuando la concentración, c, es expresada
en moles por litro se denomina“coeficiente de extinción molar” y cuando es expresada en gramos
por litro “coeficiente de extinción específico”. El término “l” representa el espesor de la capa
absorbente y está en unidades de cm.
Cuando las medidas se efectúan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas
estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta sonreproducibles,
el
término
“l”
de
la
expresión
de
la
absorbancia se hace constante. Dado que ε, es también constante para un determinado absorbente y
una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a
la concentración:
A = kc

(k = ε l).

A es adimensional, presenta valores entre O y 2 unidades de absorbancia o densidad óptica, dentro
de cuyo rango generalmente...