Laboratorista Clinico

Espectrofotometría…

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energíaradiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.
La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de laenergía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

Componentes del espectrofotómetro…
1. Fuente de luz: proporciona energía radiante en forma de luz visible ono visible.
·        Tipos de lámparas:
-                                      Lámparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta próximo. Son fuentes de un espectro continuo de energía radiante entre 360-950 nm.
-                                      Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duración y emitenenergía radiante de mayor intensidad.
-                                      Lámparas de Hidrógeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la región ultravioleta entre 220-360 nm.
-                                      Lámparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de líneas que se utilizan para calibración de longitudes de onda, se emplean solo para espectrofotómetrosy cromatografía HPLC.
2. Rendija de entrada: tiene como función reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda.
3. Monocromadores. Pueden ser:
-                                             Prismas: son fragmentos con forma de cuña de un material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible ocuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.
-                                             Redes de difracción: son un gran número de líneas paralelas situadas a distancias iguales entre sí y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metálica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un pequeño prisma.
4. Rendija de salida: tiene como función impedir que la luz difusa atraviese lacubeta de la muestra, que provocaría desviaciones a la Ley de Beer.
5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición. Pueden ser de distintos tipos y tamaños (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posición. Suelenestar fabricadas en vidrio o en plástico.
6. Detector. Puede ser de dos tipos:
·  Fotocélulas o células fotovoltaicas:
Es una lámina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de Óxido de Cobre. A ésto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y éste desprende electrones, quepasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un amperímetro que señala el paso de corriente.
Características: son resistentes; económicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batería externa, ni vacío,...; la corriente producida...