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LACTATO DESHIDROGENASA INMOVILIZADA
La enzima lactato deshidrogenasa (LDH) está formada por cuatro subunidades que forman un tetrámero de un peso molecular de 144 kDa. Cada monómero está formado por una cadena péptidica de 334 residuos de aminoácidos (36 kDa). En la estructura globular del tetrámero cada subunidad ocupa posiciones equivalentes: cada monómero cuenta con su correspondiente centroactivo. Dependiendo de las condiciones de trabajo la LDH cataliza la reacción de reducción de piruvato a lactato ó la oxidación del lactato a piruvato, utilizando como cofactor la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y su forma reducida dihidronicontinamida adenina dinucleótido (NADH) respectivamente. En la figura también se muestran el substrato lactato (rojo), el cofactor NAD+ (amarillo), ytres cadenas laterales de aminoácidos (Arg-109, Arg-171, y His-195 en verde) las cuales están directamente involucradas en el proceso de catálisis.

Figura 4.- Lactato deshidrogenasa (LDH): a) Estructura globular del tetrámero, b) reacción catalizada por la enzima y c) centro activo.
Un lazo móvil de péptido formado por los residuos de aminoácidos 98-111 se muestra también en la figura (rosa).En ausencia de substrato y del cofactor este lazo móvil se encuentra abierto permitiendo el acceso al sitio de enlace para el substrato (no mostrado). Una vez que se forma el complejo enzima-lactato-NAD+, el lazo móvil se cierra dejando aislado el centro activo. Hay dos tipos diferentes de subunidades en la LDH, la subunidad M y la subunidad H, las cuales contienen diferencias ligeras en susecuencia de aminoácidos, por lo que sus propiedades catalíticas son diferentes. De la combinación de estos dos tipos de aminoácidos se forman las cinco diferentes isoenzimas presentes en el cuerpo humano.

Proceso catalítico de la enzima inmovilizada
En la reacción catalizada por la LDH, se cataliza la transferencia de iones hidruro del lactato al cofactor NAD+ o del cofactor NADH al piruvato. Elequilibrio de la reacción favorece fuertemente la formación de lactato. Sin embargo a altas concentraciones de lactato y NAD+ la oxidación de lactato a piruvato es posible. Como la reacción es reversible, el proceso catalítico puede ser representado por un ciclo cerrado. En el análisis siguiente del ciclo catalítico de la enzima es mostrado en seis fases. Los residuos de aminoácidos en el sitioactivo de la enzima pueden intervenir en el acoplamiento del substrato y la coenzima, ó pueden tomar parte en algunos de los pasos del proceso catalítico directamente. Solamente las cadenas laterales de los tres residuos más importantes se muestran en este análisis. El grupo guanidinio cargado positivamente de la arginina-171 enlaza y orienta al grupo carboxilato del substrato por interacciónelectrostática. El grupo imidazol de la histidina-195 actúa como un donador de protón y la cadena lateral de la arginina-109 juega un papel importante en la estabilización del estado de transición. En adición a estos residuos el lazo móvil de péptido formado por los residuos 98-111 mencionado anteriormente cierra el sitio activo una vez completado el acoplamiento del substrato y el cofactor, excluyendode esta manera a las moléculas de agua durante el proceso de catálisis. En la figura se muestran las seis principales fases del proceso de catálisis de la enzima LDH.


Figura 5.- Mecanismo de catálisis de la enzima LDH.

En la enzima, el residuo His-195 se encuentra protonado. El cofactor NADH se enlaza primero, seguido por el piruvato. Es importante que el grupo carbonilo del piruvato y elsitio activo en el anillo nicotinamida del cofactor tengan una óptima posición uno con respecto al otro. En seguida el lazo de péptido 98-111 se cierra sobre el sitio activo, lo que produce un marcado descenso en la polaridad como consecuencia de la exclusión de las moléculas de agua. Esta reducción en la polaridad en el sitio activo, vuelve más fácil alcanzar el estado de transición. En el...