Metodos de determinacion de proteinas

METODOS DE DETERMINACION DE PROTEINAS

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Existen diferentes métodospara la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:
a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV.
b) para la formación de derivados químicos, o,
c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e inconvenientes

Método | Ventajas |Inconvenientes |
Métodos de Absorción | No se pierden las muestras | Interfieren muchoscompuestos que absorben el UV |
Métodos Derivados Colorimétricos |
Biuret | Bastante específico para proteínasMuestra pocas interferenciasEs barato | Tiene poca sensibilidad |
Lowry | Tiene bastante sensibilidad | No todas las proteínas reaccionanigual. Muestra muchas interferenciascomo detergentes noiónicos, sulfatoamónico etc. |
Bradford | Muy sensible | Muestra interferencias condetergentes |
BCA | Es el método mas sensibleEs el que muestra menos interferencias |
Métodos Derivados Fluorimétricos |
o-ftalaldehido | Muy sensible | La interferencia de aminascontaminantes en la muestra. No todaslas muestras reaccionan igual |

DETERMINACION DIRECTA DE PROTEINAS

Las proteínas de losalimentos contienen aminoácidos que tienen varios grupos funcionales, por lo que muestran una amplia variedad de reacciones químicas. Debido a que los alimentos contienen mezclas de proteínas, los métodos directos para la estimación de proteínas deben ser calibrados contra un método estándar de referencia para nitrógeno, por ejemplo, el procedimiento de Kjeldahl.

TITULACION CON FORMOL

Cuandose adiciona formalina a una solución acuosa neutralizada, que contiene proteínas, el grupo -NH2 reacciona para formar el grupo metilenoimino -N=CH2 con la liberación de un protón que puede titularse.

METODOS COLORIMETRICOS

Se ha empleado la reacción de Biuret que da una coloración púrpura cuando los enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos a un pH alcalino y se ha informadoque no interfieren pequeñas cantidades de azúcares reductores (Mitsuda y Mitsunaga, 1974). El método ha sido mejorado considerablemente mediante el uso de propano-2-ol y la aplicación de calor (Noll y cols., 1974). El reactivo de Folin (ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico) es reducido por las proteínas para formar un complejo azul de molibdeno.
Los colorantes de ácidos sulfonados reaccionan conproteínas a pH bajo para formar un coágulo proteína - colorante insoluble-. Si se separa este coágulo por filtración o centrifugación, la cantidad de color que permanece en el líquido sobrenadante es indirectamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra. La reacción del colorante con las proteínas es compleja y no uniforme, por lo que este método es altamente empírico y requiereestandarización y calibración.

DESTILACION DIRECTA

Debido a la presencia de los aminoácidos asparagina y glutamina que reaccionan también como amidas, los alimentos proteínicos desprenden amoníaco cuando se destilan con un exceso de solución concentrada de hidróxido de sodio. Ronalds (1974) usó esta técnica empleando el aparato de destilación de Kjeldahl para la determinación de proteínasen trigo y cebada.

METODOS AL INFRARROJO

La radiación infrarroja es la base del amplio uso de un rápido equipo automático, particularmente para leche y para granos. Las series IRMA de NEI Electronics son absorciómetros de doble rayo, diseñados para la determinación simultánea de proteínas, lactosa y grasa en la leche. La reflectancia en el infrarrojo cercano es el desarrollo más...