Metodos para la cuantificacion de proteinas

PRÁCTICA 1: MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Introducción
Para procesos como la purificación de una proteína, el calculo de la actividad especifica de una preparación enzimática o el diagnostico de enfermedades es necesario determinar la concentración de proteínas de la muestra biológica.
Para cuantificar la proteína hay distintos métodos. Estos métodos se suelen basar en trescosas: la propiedad que tienen las proteínas de absorber luz en el UV, la formación de derivados químicos o la capacidad de las proteínas para unir algunos colorantes. Cualquier método que utilicemos necesita una solución estándar de proteínas.
En esta práctica se han utilizado los métodos de Biuret y de Bradford.
Objetivo
El principal objetivo es que el alumno aprenda algunos métodos para lacuantificación de proteínas utilizando dos métodos diferentes. Se debe realizar una curva estándar para cada uno, determinar el rango de sensibilidad y cuantificar las muestras problema.
Materiales
-Tubos de ensayo
-Pipetas de automáticas regulables
-Espectrofotómetro
Teoría
Método Biuret
Esta basado en la formación de un complejo coloreado entre el cu +2 y los grupos NH de los enlacespeptídicos en medio básico (1 de cu+2 se une a 4 NH).La absorción máxima de este completo es a 540nm.A mas cantidad de proteínas mas intenso será el color, pocas sustancias interfieren en la reacción ya que es bastante especifica.
Proteína + (Cu+2)- Complejo Cu-Proteína (púrpura)
Reactivos:
-Reactivo de Biuret
-Solución de seroalbúmina bovina (SAB) de 10.000 ppm en NaCl 0,15 N.
-Solución de SAB de3000 ppm (M1) y 100 ppm (M2)
-Leche

Procedimiento:
Se hace una dilución de leche con agua de la cual se coge una fracción para hacer una segunda dilución. Se marcan los tubos con números del 1 al 15. En los 5 primeros tubos se diluye una solución concentrada de albúmina (10.000ppm), el volumen final es de 0,5 ml. En los tubos del 6 al 13 se viertes las muestras M1, M2, L1 y L2 porduplicado.
En los tubos 14 y 15 se prepara una solución como las de los primeros tubos pero se les añade EDTA(al 14) y SDS(al 15) para observar si afecta a la determinación de proteínas. En todos los tubos se añade 5 ml de Biuret, se agitan y se incuban. Finalmente se determina la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
El método tiene poca sensibilidad por lo que es conveniente usarlo paracuantificar proteínas en concentraciones altas.

Método de Bradford:
Esa basado en la unión de un colorante hidrofóbico a las proteínas, mediante una relación inespecífica. En solución acida el colorante puede ser azul o naranja. Las proteínas se unen a la forma azul formando un complejo proteína-colorante. En su determinación interfieren pocas sustancias. Algunas de esas sustancias que siinterfieren son los detergentes y las soluciones básicas (por la relación inespecífica).
Reactivos:
-Reactivo de Bradford:
-Solución de seroalbúmina bovina (SAB) de 250 ppm
-Solución de SAB de 3000 ppm (M1) y 100 ppm (M2)
-Leche

Procedimiento:
Es el mismo que en caso anterior, la diferencia se encuentra en que se añaden 5ml del reactivo Bradford en lugar del de Biuret. La absorbancia de cadamuestra se determina a una longitud de onda de 595 nm.
Resultados y cálculos
Método Biuret
Nº Tubo | SAB 10000 ppm (ml) | Agua (ml) | [SAB] ppm | Abs540 |
1 | 0 | 0,5 | 0 | 0 |
2 | 0,1 | 0,4 | 2000 | 0,04 |
3 | 0,2 | 0,3 | 4000 | 0,085 |
4 | 0,3 | 0,2 | 6000 | 0,108 |
5 | 0,4 | 0,1 | 8000 | 0,177 |

Curva de calibrado 1(Biuret):

Nota: la cuarta absorbancia medidaprobablemente no sea correcta porque el punto se aleja algo de la línea de tendencia de la grafica.
El R2 se refiere al cuadrado del coeficiente de correlacion.
Coeficiente de correlacion: 0,9892
Y= Absorbancia X= [SAB]
Conociendo la ecuación de la recta de calibrado y las absorbancias de M1 y M2 se puede calcular la concentración de M1 y M2

Nº tubo | Absorbancia | Concentraciones(ppm) |...