proteinas

Hola a todos!
Normalmente en el laboratorio de cualquier bioquímico, uno de los mayores problemas viene ligado a la purificación de un extracto de células y la obtención de una proteína en concreto para obtener una cantidad concreta de dicha proteína.
Ésto puede resultar útil para conocer los niveles de insulina de páncreas en cerdo para conocer posibles tratamientos contra la hiperglucemia.¿Cómo podemos conocer la cantidad de proteínas de un extracto de un modo simple?

Los bioquímicos, basándonos en estudios ópticos de los físicos dieron con la solución, la medida de absorbancia.
La absorbancia, es una mala traducción del inglés absorbance, que es la relación logarítmica entre la intensidad luminosa que ataca un material inicialmente y la intensidad luminosa con que ese haz deluz termina abandonando dicho material.
Todo ello viene reflejado por la Ley de Lambert-Beer tal y como se describe aquí:


Abs = Log (Io/If) = E*c*l

Si aplicamos esta relación a una cubeta que contiene una solución de proteínas podemos relacionar la cantidad de luz captada por la solución y la concentración de la misma por la tendencia proporcional lineal que las une.
De esta manera:Abs= E*c*l +Ao

¿os suena?

y= mx + n

Exacto, la Ley de Lambert-Beer expresa como una ecuación lineal esta relación, por tanto, conociendo la absorbancia de una sustancia podemos determinar su concentración en función del factor E(épsilon minúscula), el llamado coeficiente de extinción molar (CEM)

Pero esto nos plantea problemas:
1º: Necesitamos una recta de partida con una pendiente(CEM) conocida.
2º: Para construir esa recta tenemos que realizar un estudio previo con concentraciones conocidas y en orden creciente para obtener un diagrama de puntos útil.
3º: En función de lo que queramos determinar (ácidos nucleicos, proteínas, lípidos) hay multitud de ensayos tanto directos (UV) como indirectos (que pasan por una fase inicial en la que el extracto de análisis purificado sehace reaccionar con otros compuestos que provocan un cambio de color que queda registrado en un valor de absorbancia) hemos de calibrar nuestro útil (el espectofotómetro) en una determinada longitud de onda:



Finalmente, obtendremos una tabla como esta:

Absorbancia Ensayo X (Long. Onda Y nm) Concentración (uds concentración)
0.0060.006
0.009 0.011
0.012 0.013
0.024 0.023
0.035 0.038
0.0610.062
Obteniendo la siguiente gráfica:

Pues bien, los puntos son bastante lineales y los cogemos todos (R²=0.997) en este ensayo de mentirijilla.
Puntualización: la pendiente es un valor que queda estandarizado por la longitud del paso de luz en la cubeta de ensayo (1 cm), y sus unidades son Unidades Arbitrarias deAbsorbancia UAA/conc*cm.

Por tanto, si obtenemos de un extracto celular una determinada proteína y al aplicarle este ensayo obtenemos un valor de absorbancia que se corresponde con el intervalo del propio ensayo podemos utilizar el valor de la pendiente, el CEM (despreciando la longitud, que es 1 y no afecta a la dimensionalidad) conocer la concentración final de nuestra muestra para extrapolarla alconjunto de la disolución pura madre final. Vamos a hacerlo paso a paso.

1º: Obtenemos la recta patrón (HECHO).

2º: Obtenemos el valor de la pendiente (HECHO= 1.01 UAA/conc*cm)

3º: Purificamos la proteína deseada.

4º: Se toma una muestra del extracto final y se le realiza el método correspondiente a la recta patrón anterior.

5º: Si el valor de Abs = [Absorbancias medidas],...