Purificacion de proteinas

Tema 6. Purificación de proteínas

Bioquímica

TEMA 6. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 1. Introducción 2. Métodos de rotura celular y extracción de proteínas 3. Métodos cromatográficos 4. Métodos electroforéticos

1. Introducción La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un granesfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visión general de las técnicas más usuales empleadas para la purificación de proteínas, aunque muchas de ellas son aplicables a la separación de la mayoría de las moléculas biológicas. El conocimiento delproteoma, conjunto de proteínas de un organismo, ha pasado a ser el reto de la comunidad científica y de las empresas biotecnológicas, una vez que ya se ha completado la secuenciación del genoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimiento de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor, si no se identifica cual es la función de dichos genes, en sucaso, para que proteínas codifican. El programa proteoma busca la caracterización de todas las proteínas de la célula humana, identificando su secuencia de aminoácidos. Cuando se obtenga toda la secuencia de aminoácidos del proteoma humano se podrá relacionar mediante potentes programas informáticos la secuencia de aminoácidos de una proteína con el gen que la codifica. Los métodos desecuenciación tradicionales (basados en la degradación de Edman) son demasiado lentos para abordar esta ingente tarea, la secuenciación de los péptidos debe hacerse por espectometría de masas. Naturalmente las técnicas de purificación y aislamiento de proteínas son esenciales para abordar toda esta tarea. 2. Métodos de rotura celular y extracción de proteínas El primer paso en el aislamiento de una proteínaes la rotura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están:

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Lisis celular. Válido para células sin paredcelular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura. Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar lascélulas entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).

Sonicación Presión

Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter lascélulas a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o bien quecontengan además detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan los...