Separación Y Purificación. Cromatografía De Exclusión Molecular

Universidad de CHILE. FACULTAD DE CIENCIAS |
Informe de Laboratorio Nº 3 |
Proteínas III: Separación y Purificación. Cromatografía de exclusión Molecular. |
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Integrantes: Raúl Segovia Pavéz, Claudia Terraza Aguirre.Carrera: Ingeniería en Biotecnología Molecular.Curso: Bioquímica.Profesoras: Dra. Victoria Guixé, Dra. Ana Preller. |
Fecha de realización: 06/12/2011Fecha de entrega:13/12/2011 |

Introducción
El conocimiento bioquímico acerca de la estructura y función de las proteínas procede del estudio de muchas proteínas individuales. Sin embargo, para ser capaces de estudiar una proteína en detalle, es necesario separarla del resto de las proteínas, y disponer de técnicas que permitan determinar sus propiedades.

Existen numerosas técnicas que nos permiten purificarproteínas. En el presente trabajo experimental, utilizaremos una cromatografía por exclusión molecular, también llamada filtración en gel, la cual discrimina a las moléculas de acuerdo a su tamaño, pues las proteínas más grandes emergen de la columna primero que las más chicas, lo cual constituye una observación, en cierto modo, no intuitiva. El método consiste en que la fase sólida de la columnaposee unas perlas pequeñas, hechas de material entrelazado, partículas que contienen poros o cavidades cuyo tamaño ha sido calibrado, el cual se denomina Sephadex G-100. Las proteínas que presentan un mayor tamaño no pueden entrar en las cavidades, por lo que toman el camino más corto, a través de la columna, pues rodean a las partículas por el exterior, lo hace que se demoren menos, mientras quelos polipéptidos más pequeños son capaces de entrar en estos poros, siendo retardados, debido a que la trayectoria que recorren es más laberíntica, lo que provoca que emerjan después en su paso por la columna. [1]

Nuestro objetivo durante el presente trabajo experimental será separar 3 compuestos de diferente tamaño molecular, mediante la utilización de una columna de filtración en gel.Procedimiento
* Materiales:

* Columna de vidrio de 130 x 16 [mm] (~15 [ml]) llena con Sephadex G-100
* KCL 0,1 M en amortiguador fosfato 10 mM pH 7,5
* Azul dextrano 20 [mg/ml]
* OVA (ovoalbúmina) 40 [mg/ml]
* Cromato de potasio, solución saturada diluida ¼
* Reactivo de Bradford

* Procedimiento Experimental.

Se procedió según lo establecido en la Guía deTrabajos Prácticos. Curso de Bioquímica 2011. [2]

Resultados

Luego de recolectar los tubos según el procedimiento descrito en la guía de trabajos prácticos y analizar el contenido de estos en un espectofotómetro, se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla I: Absorbancia medida a 595 [nm] para zul Dextrano

Tubo | Absorbancia |
1 | 0,186 |
2 | 0,245 |
3 | 0,157 |
4 | 0,036 |
5| 0,031 |
6 | 0,021 |
7 | 0,013 |
8 | 0,009 |
9 | -0,001 |
10 | -0,004 |
11 | -0,004 |

Tabla II: Absorbancia medida a 420 [nm] para Cromato de Potasio.

Tubo | Absorbancia |
11 | 0,008 |
12 | -0,002 |
13 | 0,022 |
14 | 0,053 |
15 | 0,114 |
16 | 0,191 |
17 | 0,186 |
18 | 0,149 |
19 | 0,075 |
20 | 0,044 |
21 | 0,023 |
22 | 0,023 |
23 | 0,013 |

Luegode obtener el peack de absorbancia para el azul dextrano, a partir del siguiente tubo hasta el décimo tubo a partir de este, se agregó Reactivo de Bradford para luego medir la absorbancia de la ovoalbúmina, obteniendo los siguientes resultados:

Tabla III: Absorbancia medida a 595 [nm] para OVA. Los valores mostrados corresponden a la absorbancia corregida, puesto que la calibración delespectofotómetro se realizó con el tubo blanco y no con agua.
Tubo | Absorbancia |
3 | 0,169 |
4 | 0,226 |
5 | 0,384 |
6 | 0,295 |
7 | 0,272 |
8 | 0,199 |
9 | 0,182 |
10 | 0,165 |
11 | 0,055 |
12 | 0,054 |
13 | 0,056 |

Análisis de Resultados

Con los datos registrados anteriormente, se procedió a realizar las curvas de absorbancia para los distintos compuestos separados por...