tecnicas de blotting

Tecnicas de Blotting
El término “blotting” hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma.Este proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras que en la membrana, se encuentranaccesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma. La técnica del Western Blot (también llamado “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenosespecíficos de interés) fue descrita por primera vez por Towbin et al. en 1979 y en la actualidad es una técnica de rutina en todos los laboratorios que realizan análisis de proteínas. Laespecificidad de la unión antígeno – anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas. En la actualidad se utiliza como criterio de identificación positivode una proteína especifica en una mezcla compleja y para obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.
El primer paso de todo Western Blot es la separación de las macromoléculasmediante geles de electroforesis; después de la misma, las macromoléculas ya separadas en función de su diferente peso molecular se transfieren a una segunda matriz, generalmente una membrana denitrocelulosa o PVDF. Posteriormente, se bloquea la membrana para evitar la unión inespecífica a su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la detección de la proteína de interés. En elsiguiente paso, se une a dicha proteína transferida un anticuerpo especifico marcado con una enzima y, finalmente, se añade un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se produce un productodetectable como, por ejemplo, un precipitado cromogénico o fluorogénico en la membrana. En la actualidad, los métodos más sensibles emplean sustratos quimioluminiscentes que cuando se combinan con la enzima...