Tecnicas De Pcr

Soluciones QPCR

Protocolo y Técnicas

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Extracción y purificación de los ácidos nucleicos

Eliminación de inhibidores de la amplificación. Para algunas muestras (esputo, sangre) pueden ser necesarios más pasos que para otras (orina, LCR). Concentración de la muestra y la diana en un pequeño volumen. Algunas muestras (esputo para M.tuberculosis y Legionella pneumophila y sangre parasepsis) requieren una mayor grado de concentración que otras (orina para Chlamydia o Gonococcus) para alcanzar la sensibilidad deseada Colocación de la diana en un medio acuoso compatible con el método de amplificación Los laboratorios generalmente utilizan diferentes métodos para aislar el DNA de diferentes bacterias (ya sean gramnegativas o grampositivas); esto es un problema ya que requiere lapreparación y almacenamiento de una gran cantidad de reactivos y tampones y la utilización de diferentes protocolos de extracción. A continuación se muestra un protocolo universal de extracción de DNA genómico con el que se pueden extraer entre 100 y 400µg de DNA; consta de un módulo central (útil para la extracción de DNA de bacterias gramnegativas, incluyendo las encapsuladas y las productorasde polisacáridos) y un módulo opcional (permite la extracción de bacterias grampositivas): • Módulo central Cultivar los microorganismos en el medio más adecuado o en 5-10mL de medio de cultivo. Si se utilizan placas de agar, recoger las colonias con un asa estéril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensión (3,3mL de NaCl 3M; 1,0mL de Tris 1M pH 8,0; 2,0mL de EDTA 0,5M pH 8,0; 58,5mL desacarosa y ajustar el volumen a 100mL). Si se utiliza medio de crecimiento, centrifugar las colonias durante 5min a 3600×g a 4°C, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensión. Centrifugar la suspensión durante 5min a 3600×g a 4°C. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 3,78mL de buffer de suspensión. Añadir 200µL de SDS al 20% y mezclar completamentemediante inversión. Incubar la mezcla a 37°C durante 30min. Añadir 20µL de proteinasa K (20mg/mL), mezclar y continuar incubando a 37°C durante otro 30min. Añadir 720µL de NaCl (5M), mezclar completamente, añadir 600µL de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y mezclar por inversión. Incubar a 65°C durante 10min y a 37°C durante 5min. Añadir un volumen igual de PCI (25:24:1 fenol-cloroformo-alcoholisoamílico). Centrifugar a 1500×g durante 15min. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Añadir un volumen igual de CI (24:1 cloroformo-alcohol isoamílico) y centrifugar durante 15min a 1500×g. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Añadir 2,5 volúmenes de etanol frío al 95%, mezclar por inversión y mantener a -70°C durante 30min. Centrifugar durante 30min a 14500×g. Eliminarel sobrenadante y secar el pellet mediante vacío. Resuspender el pellet en 400µL de buffer TE (Tris HCl 10mM; EDTA 1mM pH 8,0) Añadir 1µL de una dilución 1:3 en agua estéril de RNasa T1. Incubar la mezcla a 37°C durante 1h. Centrifugar a 19900×g durante 2min. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Añadir 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M y mezclar bien. Precipitar el DNA con 2,5volúmenes de etanol frío al 95%. Mantener a -70°C durante 20-30min. Centrifugar durante 8min a 19900×g. Eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500µL de etanol al 70% y volver a centrifugar durante 8min. Descartar el sobrenadante, secar el DNA a vacío (15-30min) y disolver el pellet de DNA en 100-400µL de agua estéril. Medir la concentración de DNA en un espectrofotómetro: diluir un alícuota 1:20(15µL en 285µL de H2O), y leer a λ = 260nm. La A260 es igual a la concentración de DNA en gr/L.

02.2006

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Esquema del módulo central del protocolo universal de extracción de DNA genómico. • Módulo opcional para bacterias grampositivas Cultivar las bacterias en el medio más adecuado o en 5-10mL de...