Tinciones Diferenciales

TINCIONES DIFERENCIALES
 TINCIÓN DE GRAM
Nos da una idea de la morfología, agrupación y, además, nos permite diferenciar entre las bacterias Gram+ y las Gram-. Con el simple hecho de saber si la bacteria es Gram+ o Gram- podremos tener una idea de qué medicamento administrar a un enfermo en caso de urgencia.
Si la muestra patológica es a partir de la cual vamos a preparar la tinción, esimportante que las muestras sean lo más recientes posibles.
Si la muestra procede de un medio de cultivo, es importante que sean muy recientes y que se encuentren en la fase de crecimiento exponencial. Si son muy antiguos, las bacterias Gram+ pueden parecer Gram-.
Colorantes: se utilizan 2 colorantes: uno primario y otro secundario o de contraste.
Procedimiento
 Extender, secar, fijar
 Cubrircon cristal violeta o violeta de genciana durante 1 minuto.
 Lavar
 Cubrir 1 minuto con “lugol” (se considera un “mordiente”, es decir que intensifica el colorante aplicado como primario. Generalmente es una mezcla de una solución yodurada).
 Lavar
 Decolorar (alcohol metanol-acetona al 50%): si nos pasamos en la decoloración podemos estropear las bacterias Gram+, a pesar del grosorde su pared, debido a la acetona.
 Lavar
 Cubrir con Safranina durante 1 minuto
 Lavar
10. Secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
Resultados:
Observamos unas bacterias que no se han decolorado y que veremos violeta o morado oscuro, que serán las bacterias Gram+. También veremos otras bacterias que sí se han decolorado porque han captado el colorante de contraste(safranina) y que se verán de color rojo. Éstas últimas son las Gram-.
El violeta cristal entra en el interior tanto de las Gram+ como de las Gram-. En el caso de las Gram+, se forma un complejo violeta cristal-lugol en su interior, y debido al espesor de la capa de peptidoglucano este complejo no consigue salir de la bacteria cuando se decolora.
Por el contrario, en las bacterias Gram-, elalcohol-acetona si consigue decolorarlas y expulsa el violeta de su interior. Por eso, cuando añadimos el segundo colorante (el de contraste) éste sí entra en el interior de las Gram- que se tiñen de rojo.
Si la muestra la tomamos de un medio de cultivo sólido o líquido, es importante coger una pequeña cantidad de inóculo y extenderla bien, ya que si no veremos un cúmulo de bacterias pero nodistinguiremos las Gram+ de las Gram-.
 TINCIÓN A.A.R. (Ácido Alcohol Resistente)
Función: Se utilizan para teñir e identificar bacterias del género Micobacterium (Tuberculosis, Leprae) y Nocardia.
La diferencia fundamental de estos dos géneros con el resto es que su pared celular está constituida generalmente por CERAS, que son las que nos permiten diferenciar entre las que son Ácido Alcoholresistentes de las que no lo son.
Procedimiento:
 Extender, secar y fijar
 Cubrir la preparación con un colorante: “Carbol Fucsina” (Rojo).
 Para favorecer la penetración del colorante en la célula, hay que mantenerlo en la llama del mechero, con calor suave, durante aproximadamente 5 minutos. Enfriar.
 Lavar
 Decoloramos: utilizamos alcohol clorhídrico hasta que no sale más colorante. Lavar
 Aplicar el colorante de contraste: Azul de Metileno
 Lavar
 Secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
La extensión se hace con el asa de siembra por todo el porta. Para aplicar el calor se puede utilizar una varilla de vidrio con un algodón en uno de sus extremos que empapamos con alcohol.
Resultados:
Las bacterias ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES se verán ROJAS.Las bacterias NO ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES se verán AZULES.
La diferencia con la tinción de Gram son las bacterias que estamos intentando identificar.
Al estar constituidas por ceras, hay que utilizar el calor para favorecer la penetración de la Fucsina a través de ellas. Lavamos y decoloramos: en este caso se utiliza una mezcla de alcohol y clorhídrico que es más enérgico que el de la...