Variables De Pcr

PCR anidada.
La técnica de PCR anidada (nested PCR) consta de 2 reacciones de PCR secuenciales, utilizando como templado para la segunda reacción, el producto obtenido de la primera PCR. Primera reacción de PCR: denaturación inicial a 95°C por 3 m y 30 ciclos caracterizados por una etapa de denaturación a 95°C por 30 s, alineamiento a 57°C por 30 s y una etapa final de polimerización a 72°C por30 s. Finalmente una etapa de polimerización a 72°C por 5 m. La segunda reacción de PCR fue idéntica a la primera, exceptuando la etapa cíclica en que el alineamiento se realizó con una mayor estrictez, esto es a 70°C.
Posibilita la detección de borrelias no restringidas al grupo sensu stricto, esta estrategia permite detectar borrelias más distantes evolutivamente, esto es, del grupo másdiverso denominado B burgdorferi sensu lato.
PCR Semi-anidada.
Es una PCR anidada en la que sólo se utiliza uno de los cebadores internos. El método no añade mucha especificidad pero en ciertas aplicaciones añade la suficiente especificidad para conseguir el producto PCR deseado. De esta forma, para la detección de genes IgH reordenados clonalmente puede utilizarse PCR semi-anidada.
PCR asimétricaProduce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar los dos cebadores necesarios a concentraciones molares distintas en una relación entre 50/1 y 100/1. así se produce ADN de doble cadena en cantidad exponencial hasta que se agota el cebador minoritario y luego sólo se produce la cadena que hibrida con el ADN que se encuentra en exceso, produciéndose a partir de entonces de forma lineal. Deesta forma el producto de PCR contiene 10 a 20 veces más de ADN monocatenario que de ADN bicatenario. Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario se puede utilizar para una secuenciación directa con la técnica de Sanger.
PCR en tiempo real.
También se le llama PCR cuantitativa, se utiliza para cuantificar el producto de la amplificación de ADN al mismo tiempo que la amplificación se estállevando a cabo, para lograrlo se adiciona al ADN polimerasa termoestable utilizado normalmente en la PCR una sustancia marcada con un fluoróforo que en un termociclador con sensores para medir fluorescencia permite medir la tasa de generación del ADN que se quiere conseguir. La medición se realiza después de cada ciclo, este es el motivo por el que se le llama PCR en tiempo real.
Esta técnica seutiliza para conocer el genotipo y cuantificar los patógenos virales en humanos, como por ejemplo el virus de la Hepatitis B, la cuantificación se realiza mediante retrotranscripción en caso de que el virus a tratar se integre en algún momento de su ciclo en el genoma humano, como por ejemplo el Virus del Papiloma Humano
PCR con transcriptasa inversa.
Se usa ARN como molde inicial en lugar deADN, y se utiliza una transcriptasa inversa para la síntesis de ADN complementario al ARN, una vez que se obtiene el ADN complementario (ADNc) se siguen los pasos de la PCR estándar amplificando la primera hebra de ADN complementario.
Esta técnica de PCR se utiliza como un método para poder estudiar el genoma de retrovirus como el Virus de Inmunodeficiencia Humana, además, debido a que el ADNcomplementario que se obtiene a partir del ARN ya no lleva intrones, se puede generar un ARNm formado sólo por exones, esto ha permitido insertar genes eucariotas en organismos procariotas, esta es la utilidad más importante de la técnica de RT-PCR.
PCR múltiplex
Consiste en hacer diversas amplificaciones en el mismo tubo de reacción colocando múltiples parejas de cebadores. Las secuencias adetectar han de estar lo suficientemente lejos unas de otras para que las amplificaciones no interfieran entre sí8O.
Esta técnica se utiliza en la detección del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne; un gen enorme (de mas de 2 millones de pares de bases), que no es adecuado para ser estudiado mediante análisis indirecto, y que además presenta una marcada heterogeneidad en sus...