acetona
Páginas: 9 (2145 palabras)
Publicado: 2 de abril de 2014
Pontificia Universidad Católica de Chile
Facultad de Ciencias Biológicas
Departamento de Biología Celular y Molecular
Laboratorio de Bioquímica y Biología celular - BIO297C
PRÁCTICO II
“Fraccionamiento Subcelular”
Homogeneización y centrifugación diferencial
Medición de proteínas y NABGASA
Integrantes:
María Francisca Barrera
Teresita Caraccioli
MiguelFerrada
Valentina Lira
Profesora: María Estela Andrés
Instructora: Marcela González
Ayudante: Cledi Cerda
Fecha de entrega: 3 de Abril 2014
Introducción
El análisis de los componentes intracelulares se ha convertido en un factor de gran importancia a la hora de hacer investigaciones relacionadas con la bioquímica y la biología celular. Para poder analizar estos elementos existen distintastécnicas, entre las cuales se encuentra el fraccionamiento sub-celular que separa organelos mediante centrifugación tras someter a la célula a un proceso de lisis (1). Lo primero que se realiza es una homogenización de la muestra por un proceso mecánico o físico para lisar la célula y debe hacerse en un medio que permita la conservación de la estructura y función de los distintos componentes. Luego deobtener el homogenizado se lleva a centrifugación diferencial que permite separar sus componentes según sus velocidades de sedimentación (2), la cual depende del volumen, densidad, forma y radio del componente celular; de la densidad y viscosidad del medio (3).
La centrifugación diferencial depende de la velocidad de sedimentación de cada partícula, esto quiere decir que se basa en laaplicación de un campo centrífugo creciente al homogenizado (2). La centrifugación forma un precipitado que será la fracción rescatada y un sobrenadante que continua centrifugándose (4). La primera centrifugación separa la fracción N (sedimento nuclear) del extracto (E), luego se separa la fracción M (mitocondrias), luego la fracción L (organelos pequeños), luego la fracción P (microsomas), y finalmente seobtiene la fracción S (enzimas y proteínas solubles) (2).
La eficiencia de la separación y purificación de los distintos componentes subcelulares en el proceso de fraccionamiento subcelular se evalúa mediante determinación de enzimas marcadoras que se distribuyen exclusivamente en un organelo (5), por lo que a través de la determinación de actividad enzimática de éstas se pueden identificar loscomponentes de las fracciones obtenidas. Un ejemplo de enzima marcadora es N-Acetil-B-Glucosaminidasa (NABGASA) que es un marcador lisosomal. La determinación de la actividad enzimática se realiza midiendo la aparición de p-nitrofenol (compuesto con coloración amarilla) liberado por la acción de la enzima sobre p-nitrofenil-2-acetamida-2-deoxi-B-D-glucopiranósido (pNFAGP) alrededor de un pH 4,5(2). Luego se mide la absorbancia para determinar en qué fracción se encuentra la mayor cantidad de esta enzima.
Por otro lado, para conocer el contenido proteico de las fracciones obtenidas por centrifugación, es necesario conocer cuantitativamente la concentración de las proteínas (6). Actualmente hay distintas técnicas que se basan en la formación de complejos coloridos entre las proteínas yreactivos específicos (7), dentro de estas se encuentra el método de Lowry que consiste en la determinación espectrofotométrica de un producto coloreado en dos reacciones consecutivas (8). La primera reacción es con Cu+2, que en medio alcalino produce color azulado por la reacción de Biuret, donde el Cu+2 reacciona con los enlaces peptídicos de las proteínas (9). La segunda reacción es con reactivode Folin-Ciocalteau, que intensifica el color al interactuar con el grupo fenólico de los aminoácidos tirosina y triptófano (10).
En esta experiencia se busca conocer los fundamentos, etapas y aplicaciones del fraccionamiento subcelular, integrando también otros procedimientos experimentales como centrifugación y espectrofotometría, se realiza un fraccionamiento subcelular de hígado de...
Pontificia Universidad Católica de Chile
Facultad de Ciencias Biológicas
Departamento de Biología Celular y Molecular
Laboratorio de Bioquímica y Biología celular - BIO297C
PRÁCTICO II
“Fraccionamiento Subcelular”
Homogeneización y centrifugación diferencial
Medición de proteínas y NABGASA
Integrantes:
María Francisca Barrera
Teresita Caraccioli
MiguelFerrada
Valentina Lira
Profesora: María Estela Andrés
Instructora: Marcela González
Ayudante: Cledi Cerda
Fecha de entrega: 3 de Abril 2014
Introducción
El análisis de los componentes intracelulares se ha convertido en un factor de gran importancia a la hora de hacer investigaciones relacionadas con la bioquímica y la biología celular. Para poder analizar estos elementos existen distintastécnicas, entre las cuales se encuentra el fraccionamiento sub-celular que separa organelos mediante centrifugación tras someter a la célula a un proceso de lisis (1). Lo primero que se realiza es una homogenización de la muestra por un proceso mecánico o físico para lisar la célula y debe hacerse en un medio que permita la conservación de la estructura y función de los distintos componentes. Luego deobtener el homogenizado se lleva a centrifugación diferencial que permite separar sus componentes según sus velocidades de sedimentación (2), la cual depende del volumen, densidad, forma y radio del componente celular; de la densidad y viscosidad del medio (3).
La centrifugación diferencial depende de la velocidad de sedimentación de cada partícula, esto quiere decir que se basa en laaplicación de un campo centrífugo creciente al homogenizado (2). La centrifugación forma un precipitado que será la fracción rescatada y un sobrenadante que continua centrifugándose (4). La primera centrifugación separa la fracción N (sedimento nuclear) del extracto (E), luego se separa la fracción M (mitocondrias), luego la fracción L (organelos pequeños), luego la fracción P (microsomas), y finalmente seobtiene la fracción S (enzimas y proteínas solubles) (2).
La eficiencia de la separación y purificación de los distintos componentes subcelulares en el proceso de fraccionamiento subcelular se evalúa mediante determinación de enzimas marcadoras que se distribuyen exclusivamente en un organelo (5), por lo que a través de la determinación de actividad enzimática de éstas se pueden identificar loscomponentes de las fracciones obtenidas. Un ejemplo de enzima marcadora es N-Acetil-B-Glucosaminidasa (NABGASA) que es un marcador lisosomal. La determinación de la actividad enzimática se realiza midiendo la aparición de p-nitrofenol (compuesto con coloración amarilla) liberado por la acción de la enzima sobre p-nitrofenil-2-acetamida-2-deoxi-B-D-glucopiranósido (pNFAGP) alrededor de un pH 4,5(2). Luego se mide la absorbancia para determinar en qué fracción se encuentra la mayor cantidad de esta enzima.
Por otro lado, para conocer el contenido proteico de las fracciones obtenidas por centrifugación, es necesario conocer cuantitativamente la concentración de las proteínas (6). Actualmente hay distintas técnicas que se basan en la formación de complejos coloridos entre las proteínas yreactivos específicos (7), dentro de estas se encuentra el método de Lowry que consiste en la determinación espectrofotométrica de un producto coloreado en dos reacciones consecutivas (8). La primera reacción es con Cu+2, que en medio alcalino produce color azulado por la reacción de Biuret, donde el Cu+2 reacciona con los enlaces peptídicos de las proteínas (9). La segunda reacción es con reactivode Folin-Ciocalteau, que intensifica el color al interactuar con el grupo fenólico de los aminoácidos tirosina y triptófano (10).
En esta experiencia se busca conocer los fundamentos, etapas y aplicaciones del fraccionamiento subcelular, integrando también otros procedimientos experimentales como centrifugación y espectrofotometría, se realiza un fraccionamiento subcelular de hígado de...
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