ADN en cebollas

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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. REACCIÓN DE LA CATALASA

1. FUNDAMENTO.
La catalasa es una enzima presente en todas las células vivas (con
algunas excepciones, como entre microorganismos anaerobios), pero está
especialmente abundante en sangre e hígado. Se ha preparado en forma
cristalina de ambas fuentes. La enzima es altamente específica y actuará sólo
sobre el H2O2, que hace de sustrato, aunqueutilizará peróxidos alquílicos
como dadores de electrones. Cataliza la siguiente reacción:
H2O2  H2O + ½ O2
El peróxido de hidrógeno es producto de distintas oxidaciones
celulares, y la catalasa está presente en las células para evitar la
acumulación de H2O2. Es una de las enzimas más activas conocidas.
La actividad de la catalasa se ha determinado por distintos métodos.
Uno

conveniente,aunque

aproximado,

es

determinar

el

H 2O2

no

descompuesto por valoración con permanganato después de incubar la
enzima con un exceso de H2O2. Se deja actuar la enzima en una solución
diluida de peróxido durante 5 minutos y la reacción se para por la adición de
ácido sulfúrico que destruye la enzima. La reacción de valoración es:
2 MnO4- + 5 H2O2 + 6 H+  5 O2 + 2 Mn2++ 8 H2O
La azida o los iones cianuro forman complejos muy estables e inactivan
enzimas que contienen iones férricos, pero sólo tienen un pequeño efecto en
enzimas que contienen iones ferrosos. Los citocromos, catalasa y peróxidos
contienen la forma férrica y, por lo tanto, están fuertemente inhibidos por
azida o cianuro.

2. MATERIAL.
* Cristalizador o cubeta de plástico
* Hielo
* 3erlenmeyers pequeños
* Pipetas de las siguientes medidas: 110 mL, 22 mL, 21mL, 10.5 mL
* Lanceta estéril
* Probeta de 50 mL
* Bureta de 25 ó 50 mL
* Propipetas
3. DISOLUCIONES o REACTIVOS.
* Sangre humana
* Tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7.0
* H2O2 (aprox. 50 mM) en tampón fosfato sódico 20 mM de pH 7.0
* Azida sódica 5x10-5 M
* KMnO4 2.5 mM
* H2SO4 6 N

4. DESARROLLO.
Como fuentede enzima se utiliza sangre fresca en una dilución de
1:500. Para ello, se colocan 25 mL de agua destilada fría en un erlenmeyer de
50 mL que esté en la cubeta de plástico con agua fría y hielo. Se obtienen dos
o tres gotas de muestra de sangre de la punta del dedo pinchando con una
lanceta estéril. Se descarga la sangre en el erlenmeyer que contiene el agua
fría. Agitad el erlenmeyer paraconseguir una mezcla homogénea. Mantened
la sangre diluida en frío a lo largo de todo el experimento para minimizar la
inactivación por calor.
Se preparan los erlenmeyers pequeños como se indica en la tabla
siguiente, añadiendo las cantidades correspondientes a cada uno de ellos. La
reacción debe realizarse en frío, con el baño de hielo. Después de cada
adición al erlenmeyer hay que agitarlobien. LAS DETERMINACIONES
DEBEN REALIZARSE POR DUPLICADO. (CONSEJO: Es preferible preparar

los 2 erlenmeyers del mismo nº al mismo tiempo, y cuando se ha cortado la
reacción empezar con los de otro nº).
Para parar la reacción, al cabo de 5 minutos de estar
reaccionando en frío la enzima se añaden 2 mL de H 2SO4 6 N al
erlenmeyer correspondiente.
El nº 1 es el blanco de la reacción yrepresenta la cantidad total de
H2O2 añadida en cada erlenmeyer. En este caso, la adición de 2 mL de H 2SO4
6 N precede a la adición de la enzima y no es necesario que el erlenmeyer
se mantenga 5 min. en frío ya que no hay reacción. Se puede valorar
directamente.
El erlenmeyer nº 3 corresponde al efecto de la temperatura sobre la
actividad de la enzima. Por ello se debe poner en un tubo deensayo unos dos
mililitros de catalasa y calentarse en agua a 50 ºC alrededor de 5 a 10
minutos. A continuación, cuando se tenga que poner la cantidad
correspondiente de "catalasa calentada", se coge de este tubo.

Nª erlenmeyer
Tampón fosfato, pH 7.0
(mL)
H2O2 (mL)
Agua (mL)
Azida 5x10-5 M (mL)
Catalasa (mL)
Catalasa calentada (mL)

1
(control)

2

3
(temp.)

4 (inhib.)

5...