Adn Extraccion De Pichica
Páginas: 3 (615 palabras)
Publicado: 30 de enero de 2013
Práctica No 1
Preparación de DNA Genómico a partir de levaduras
Pichia pastoris Técnica de TSNT
Práctica No 1 Técnica de TSNT
El aislamiento del DNA por la técnica de TSNT es una delas técnicas más empleadas en biología molecular para obtener DNA genómico de alta calidad.
Material y Equipo
EQUIPO
• Agitador Vortex • Autoclave • Campana bacteriológica • Congelador de -20 C •Incubadora a 37 C, con agitación • Juego de micropipetas • Maquina de hielo • Centrífuga • Microcentrífuga • pH metro • Refrigerador
Material y Equipo
EQUIPO
• Transiluminador • Equipo paraelectroforesis - Cámaras horizontales - Fuentes de poder - Accesorios • Baños de agua
Material y Equipo
MATERIALES
• Gradillas de plástico • Guantes desechables • Hieleras • Mechero • Cajas deplástico para guardar tubos con muestra • Contenedores para desechos químicos • Contenedores para desechos de material biológico • Puntillas para micropipetas (azules y amarillas) • Tubos Eppendorf de(1.5ml o 2ml)
Material Biológico, soluciones, medios de cultivo y reactivos
MATERIALES
• Cepa de P. pastoris pPic α-Glu, KM71 • Medio de cultivo YPD (Extracto de levadura 1%, Peptona 2%, Glucosa 2%)• TSNT (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100mM, Tris-HCl 10mM y EDTA 1mM pH=8) • Fenol • SEVAG (cloroformo: alcohol isoamílico, 24:1) • TE 1x (Tris-HCl 10 mM pH=8, y EDTA 1mM pH=8) • Etanol al100% • Etanol al 70% • RNAsa
Crecimiento celular
100 µL cepa KM71 de Pichia pastoris 10 mL de YPD
Incubar a 30ºC, 250 rpm por 24 horas. Hasta alcanzar la fase exponencial (DO600 nm de 6-10).4 mL del cultivo por centrifugaciones sucesivas
Guardar el paquete celular a -20 C para su posterior uso
Eppendorf de 2 mL
Paquete celular
Centrifugar por 5-10 minutos a 16,000 g paraseparar el paquete celular, decantar el sobrenadante.
Proceso general
Homogenización (Lísis celular) Extracción de contaminantes (Remoción de proteínas y RNA) Precipitación y lavado del DNA...
Preparación de DNA Genómico a partir de levaduras
Pichia pastoris Técnica de TSNT
Práctica No 1 Técnica de TSNT
El aislamiento del DNA por la técnica de TSNT es una delas técnicas más empleadas en biología molecular para obtener DNA genómico de alta calidad.
Material y Equipo
EQUIPO
• Agitador Vortex • Autoclave • Campana bacteriológica • Congelador de -20 C •Incubadora a 37 C, con agitación • Juego de micropipetas • Maquina de hielo • Centrífuga • Microcentrífuga • pH metro • Refrigerador
Material y Equipo
EQUIPO
• Transiluminador • Equipo paraelectroforesis - Cámaras horizontales - Fuentes de poder - Accesorios • Baños de agua
Material y Equipo
MATERIALES
• Gradillas de plástico • Guantes desechables • Hieleras • Mechero • Cajas deplástico para guardar tubos con muestra • Contenedores para desechos químicos • Contenedores para desechos de material biológico • Puntillas para micropipetas (azules y amarillas) • Tubos Eppendorf de(1.5ml o 2ml)
Material Biológico, soluciones, medios de cultivo y reactivos
MATERIALES
• Cepa de P. pastoris pPic α-Glu, KM71 • Medio de cultivo YPD (Extracto de levadura 1%, Peptona 2%, Glucosa 2%)• TSNT (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100mM, Tris-HCl 10mM y EDTA 1mM pH=8) • Fenol • SEVAG (cloroformo: alcohol isoamílico, 24:1) • TE 1x (Tris-HCl 10 mM pH=8, y EDTA 1mM pH=8) • Etanol al100% • Etanol al 70% • RNAsa
Crecimiento celular
100 µL cepa KM71 de Pichia pastoris 10 mL de YPD
Incubar a 30ºC, 250 rpm por 24 horas. Hasta alcanzar la fase exponencial (DO600 nm de 6-10).4 mL del cultivo por centrifugaciones sucesivas
Guardar el paquete celular a -20 C para su posterior uso
Eppendorf de 2 mL
Paquete celular
Centrifugar por 5-10 minutos a 16,000 g paraseparar el paquete celular, decantar el sobrenadante.
Proceso general
Homogenización (Lísis celular) Extracción de contaminantes (Remoción de proteínas y RNA) Precipitación y lavado del DNA...
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