Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica.

Este procedimiento es crítico y necesario para realizar los cualquier estudio funcional de células mononucleares (monocitos, macrófagos, células NK y linfocitos T y B). El aislamiento de éstos se puede hacer a partir de muestras de sangre periférica, órganos linfoides u otros tejidos. Este aislamiento se puede realizar por variosmétodos pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque.

El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que flotenlas células mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica para nuestro estudio (Fig. 1).

Figura 1.

MATERIALES

•Tubos cónicos para centrífuga de 15 mL estériles (06 tubos)
•Tubo cónico de plástico de 50 mL estéril (01 tubo)
•Probetas de vidrio 50 mL (02)
•Ficoll-Hypaque (Lymphoprep™, 2mL por muestra)
•Suero Fisiológico estéril (50 mL)
•Pipetas de 10 mL estériles
•Pipetas Pasteur de plástico estériles
•Guantes de látex o vinilo estériles
••Gradillas
•Centrífuga
•Campana de flujo laminar (en caso de no disponer de una, disponer de un ambiente donde trabajar con la máxima esterilidad posible)

PROCEDIMIENTO

1. Importante tener el Ficoll-Hypaque a temperaturaambiente.
2. Durante todo el procedimiento trabajar con las máximas medidas de esterilidad y bioseguridad (la esterilidad depende de la disposición final del ensayo si es para cultivo, se requiere esterilidad), de ser posible dentro de campana de flujo laminar o ambiente dispuesto para tal procedimiento.
3. La superficie de trabajo debe estar limpia, usar guantes y bata de laboratorio.
4. Dispensar 6mL de suero fisiológico por cada 3 mL de sangre.
5. Dispensar 2 mL de Ficoll-Hypaque en tubos de 15 mL por cada 9 mL de sangre diluida.
6. Colocar los cuatro tubos cónicos de centrífuga en gradilla y dispensar 2 mL de Ficoll-Hypaque en cada tubo utilizando pipeta milimetrada.
7. En tubo de aparte, mezclar 3 mL de sangre con 6 mL de suero fisiológico utilizando pipetas milimetradas.

8. Cargar9 mL de sangre diluida con suero fisiológico en pipeta milimetrada y dispensar muy cuidadosamente y lentamente sobre el tubo que contiene el Ficoll-Hypaque. Poner el tubo inclinado y apoyar la punta de la pipeta sobre la pared del tubo para dejar deslizar la sangre suavemente sobre el Ficoll y poder formar una interfase (Ficoll abajo y sangre arriba).

9. Repetir la acción en cada uno de lostubos de centrífuga que contienen Ficoll. Se puede utilizar la misma pipeta.
10. Cubrir todos los tubos y llevar a centrifugar.
11. Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 30 minutos, a temperatura ambiente y sin freno al final de centrifugación.

Nota: Durante este tiempo de centrifugación. Analice las placas que se le entreguen identifique mononucleares (monocitos y linfocitos), glóbulos rojos,polimorfonucleares neutrófilos. Estas placas fueron teñidas con cristal violeta (violeta de genciana).

12. Retirar cuidadosamente de la centrifuga y llevar a la gradilla. Verificar la formación de las fases de gradiente de densidad (arriba el plasma sanguíneo, debajo la banda de células mononucleares, debajo el Ficoll-Hypaque, debajo las células PMNs y debajo los eritrocitos aglutinados).
13.Extraer toda la banda de células mononucleares utilizando pipetas pasteur de plástico y dispensar en tubo de centrifugación nuevo. Dispensar las cuatro bandas en un único tubo de centrifugación y luego completar hasta 15 mL con suero fisiológico. Cubrir tubo y llevar a centrifugación.
14. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la...