Aislamiento Y Purificación La Proteína Alfa-Lactalbúmina De La Leche

Pontificia Universidad Católica
Facultad de Química
Departamento de Química-Física
Bioquímica T-P QQO-2402






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NOMBRE: Claudio Contador R
CURSO: Bioquímica T-P QQO-2402
FECHA DE ENTREGA: 2 de Septiembre del 2004


Introducción.

En el laboratorio, la práctica a realizar corresponde al aislamiento y purificación de una proteína muyimportante de la leche la cual se conoce con el nombre alfa-lactalbúmina.
Esta proteína, de tipo globular, presenta características como ser solubles ya que sus residuos de aminoácidos polares, ácidos y básicos establecen interacciones con el agua donde se encuentra inmersa. Pero cuando existen agentes que rompen estas interacciones de los residuos con el agua, esto conlleva a una disminución de lasolubilidad de nuestra proteína, lo que provoca que esta precipite en la solución.

Otro factor importante que provoca que las proteínas precipiten es el pH, debido a que un cambio de pH en solución produce alteraciones en el estado iónico de las moléculas proteicas, pudiendo llevarlas a un estado de carga neutro, llamado Punto Isoelectrónico donde la solubilidad pasa a ser mínima,lo que a su vez hace que las moléculas, en este caso las proteínas, no se repelan entre si juntándose y así comenzando a precipitar en la solución.


Los procesos a realizar para purificar nuestra proteína de leche constan, primero, de tratarla con sal de sulfato de sodio, que es un agente precipitante ya que este se solvata con facilidad disminuyendo la cantidad de agua que podríainteractuar con nuestra proteína, provocando la precipitación de la caseína. Luego la alfa-lactalbúmina, presente en las aguas madres del precipitado, debe ser llevada a ambientes ácidos y básicos para ser separada y purificada del resto de las proteínas de la leche, esta separación se lleva a cabo adicionando HCl hasta alcanzar un pH aproximado de 3,0 donde la mencionada proteína es insoluble, luegose descarta el sobrenadante, para finalmente cambiar a un medio básico con adición de NaOH 1N, para que la proteína quede pura y en solución. Luego se trabaja con la curva de calibración y con los datos obtenidos para determinar la concentración de la proteína en la leche.



Objetivos:

Luego de tener el conocimiento de los métodos de aislamiento y purificación de una proteína de laleche, que en este caso es la alfa-lactoalbúmina, iremos siguiendo pasos para determinar la concentración de nuestra proteína en un volumen inicial de leche. Cabe destacar que nuestro resultado será estudiado y comparado con una curva de calibración por medio del Método de Biuret, realizada con una solución patrón de nuestra proteína. para establecer un rango de absorbancia el cual sirve para medirla concentración a conocer de la proteína mencionada, ya que ésta estará dentro de aquel rango determinado mediante los patrones indicados.








Análisis y Resultados.
❖ Práctica


Se utilizó 25 ml de una solución estándar de proteína patrón, de concentración 5mg/ml. Se prepararon 9 tubos de distinta concentración de proteína estándar con agua. De cada tubo se tomó 1 ml desolución y se le agregó 4 ml de reactivo de Biuret. Se dejaron los tubos a temperatura ambiente y se les midió la absorbancia, con el fin de hacer una curva de calibración.

Cálculos de concentración proteína en cada tubo (Método de Biuret):
La formula a ocupar para cada tubo es V1*C1=V2*C2, donde C1= 5mg/ml siempre y V2 es el volumen total, que para cada tubo siempre es 2.50ml


|Tubo n°|ml de solución |ml de Agua |Aplicando fórmula para cada volumen |Concentración C2 para cada|
| |Estandar | |de Solución estandar |tubo en el volumen total |
|Tubo n°1 |0.00 |2.50 |5mg/ml*0.00ml= C2*2.50 |0.0mg/ml |
|Tubo n°2 |0.25 |2.25...