anticuerpos

Producción de Anticuerpos Monoclonales de origen Múrido
Inmunización
En teoría, es factible producir anticuerpos monoclonales específicos para cualquier antígeno capaz de ser reconocido por los linfocitos B. Para la inmunización es conveniente el uso de preparaciones puras de antígeno en las cuales el peligro de competencia antigénica, que pudiese desviar la respuesta inmune humoral hacia unamolécula irrelevante, no existe. Pero en muchos casos el antígeno de interés se encuentra en una molécula de la superficie celular difícil de aislar, lo que obliga a la utilización de células Completas o extractos de membranas para la inmunización (Goding, 1980). En otros casos, por ejemplo cuando se trata de drogas o moléculas pequeñas, éstas deben ser conjugadas a portadores, y son estosconjugados las preparaciones usadas para la inmunización (Hudson y Hay, 1989).
A menos que se trate de moléculas poco inmunogénicas, la inmunización se realiza rutinariamente mediante la inyección M antígeno por vía subcutánea o intraperitoneal y en la forma de una emulsión. Ello permite la liberación lenta y constante del antígeno, asegurando una estimulación permanente. Esta inmunización se efectúa enmúltiples ocasiones, normalmente en intervalos de dos semanas, para asegurar una buena estimulación y amplificación de los clones de linfocitos B específicos para el antígeno de interés (Harlow y Lane, 1988). La última estimulación usualmente se hace tres días antes de la fusión y por vía intravenosa para así obtener, en el bazo del animal inmunizado, una máxima respuesta y una población decélulas respondientes en fase de división.
Fusión
Luego de culminado el protocolo de inmunización y que se tiene la certeza de que el mismo ha sido efectivo, el animal experimental es sacrificado y se le extrae el bazo. Los linfocitos B, bien como parte del total de la suspensión de células esplénicas o previamente purificados, se mezclan con un número apropiado de células de mieloma que se mantienencreciendo exponencialmente in vitro. Lo que sigue a continuación es el proceso de fusión en sí, el cual debe realizarse a 37º y consiste en añadir a la mezcla de células un pequeño volumen de un agente fusógeno denominado polietilenglicol (PEG), mezclando suavemente por espacio de uno a tres minutos. En estas condiciones, las membranas de algunas de las células se fusionan, uniéndose loscitoplasmas y formándose los hibridomas. El PEG luego se elimina por lavado y las células fusionadas se siembran en microplacas de cultivo (Yokoyama, 1992).
El proceso de fusión es muy ineficiente: en general, menos del 1% de las células terminan fusionándose (Johnstone y Thorpe, 1987; Harlow y Lane, 1988). Esto trae como consecuencia que se requiera de un número de células relativamente alto para elproceso de fusión (un bazo de ratón contiene del orden de 101 células). En algunas circunstancias es posible enriquecer la población de linfocitos B específicos para el antígeno, lo cual se logra asociando el antígeno a una fase sólida y utilizando procedimientos de aislamiento como separación inmunomagnética (Ossendorp et al., 1989 Lundkvist et al., 1993) o roseteo con glóbulos rojos recubiertos conel antígeno de interés (Myers et al., 1986). De tenerse el equipo necesario, en los casos en los que se dispone de pocas células, es preferible realizar la fusión mediante el proceso denominado electrofusión, el cual resulta mucho más eficiente (Foung, 1990).
Selección
Dado que la fusión es un evento completamente al azar, la mezcla de células obtenidas luego de la misma estará formada poresplenocitos, células de mieloma, esplenocitos fusionados entre sí, células de mieloma fusionadas entre sí y además por los hibridomas linfocito B-célula de mieloma. En cultivo, los esplenocitos no fusionados mueren con el tiempo por ser células normales. Sin embargo, las mielomatosas al ser células tumorales pueden vivir indefinidamente y como se replican con mayor rapidez que los hibridomas,...