apuntes fisiologia

CONTROL DE LA SECRECIÓN PANCREÁTICA
EXOCRINA

HISTAMINA

H1+ 2-thiazolylethylamine
H1- clorfeniramina
H2+ dimaprit
HISTAMINA Y SECRECIÓN
H2cimetidina EXOCRINA
PANCREÁTICA

H2- oxmetidina

Papel de la histamina en el control de la secreción pancreática exocrina

Histamine (nmol/Kg/min)

Histamine (nmol/Kg/min)

Agents and Actions 30, 1990

Papel de la histamina enel control de la secreción pancreática exocrina
Agonista H1

Agonista H2

Dimaprit (nmol/kg/min)

Antagonista H1

Antagonista H2

Cimetidine(µmol/Kg)

Agents and Actions 28, 1989

Antagonistas H2

HISTAMINA

Agonistas H2

R-H2

R-H1
Inhibición
SPE
Estimulación
SPE
Agonistas
H1

Antagonistas H1

Exocitosis

Ca2+
X?

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

IP3RPKC

Ca2+
Ca2+
2+
Ca
Ca2+
2+
Ca2+ Ca

Ca2+

DAG

+ IP3

Ca2+

Ca2+

Ca2+ Ca2+
Ca2+ Ca2+

RyR

PLC

G
G

PIP2

Ca2+

ACh
CCK

Ca2+
Ca2+

Ca2+

PMCA
Na+

• Animales: Ratones Swiss
• Aislamiento acinos pancreáticos:
– Digestión enzimática:
Injección colagenasa
Incubacion (37ºC), 5-7 min.

– Disgregación mecánica
– Centrifugación (30 g, 2 min., 4ºC)– Disociación mecánica

– Test viabilidad
• Trypan-Blue
• Calceina: 5 µM, 30 min, R.T. (λext 490 nm, λem 520 nm)

© Cultivo línea celular pancreática AR42J: RPMI + glutamina + FBS, 5% CO2-95% O2

ASA

+ ACD (1/6)

(100 µM)

+
Apirasa (0.2 U/mL)

Extracción de sangre

@ 20´ a 350 g
Tests de viabilidad
Método de Trypan-Blue

Métodos fluorescentes
- Calceina

HBS + ApirasaCULTIVO DE CÉLULAS HL-60
Línea de células leucémicas
promielocíticas humanas HL-60.
-

RPMI1640

-

10% (v/v) de suero bovino fetal

-

1,25% de DMSO

-

1% de L-glutamina

-

100 U/mL de penicilina y 100
U/mL de estreptomicina

-

37 ºC en una atmósfera húmeda
que contenía 5% de CO2.

-

La viabilidad fue medida usando
el colorante trypan blue.

MATERIALAND METHODS
Cell viability
• Trypan blue exclusion: optic microscopy
- Trypan blue 0.4%. Count of cells (Neubauer chamber)

• Calcein: spectrofluorophotometer
- Incubation conditions: 5 µM for 30 min. Room temperature
λexcitation =490 nm; λemision =520 nm

Cell viability > 95%

Suspensiones celulares: espectrofluorímetro

• Cuantificación de [Ca2+]c: Fura-2/AM
- Condicionesincubación: 4 µM for 40 min, R.T.
λexcitation =340/380 nm; λemision =505 nm

• Determinación producción EROs: CM-H2DCFDA
- Condiciones incubación: 10 µM for 40 min, R.T.
λexcitation =488 nm; λemision =530 nm

340 nm
488 nm
380 nm

505
530 nm

Ratio=
/F380
F/F0 *F340
100

Señal de calcio y Especies Reactivas de Oxígeno (EROs)

EROs como mensajeros intracelulares:
- EROs y señal decalcio

Reduced
extrusion

Ca2+

ROS activate
ECC

PMCA

Ca2+ channel
X
NC

Na+

[Ca2+]c
NCX

R

IP3

PTP
+

SERCA
Θ

Uniporter

ER/SR
[Ca2+]s

Ca2+ release from
the mitochondrial
pool

Reduced
reuptake

Ca2+ release
from the ER

Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 6, 2006

Señal de calcio y especies reactivas de oxígeno
B

A

H2O2 1 mM, 0 mM[Ca2+]0

2.0

F340/380

1.5

1.0

0.5

1.0

0.5

0.0

0.0

0

250

500

750

1000

1250

1500

0

250

500

Time (sec)

750

1000

1250

1500

Time (sec)
B

C
FCCP 0.5 µM

2.0

2.0

H2O2 1 mM

H2O2 1 mM

TPS 0.5 µM

F340/380

1.5

F340/380

F340/380

1.5

H2 O2 1 mM

CCK-8 1nM

2.0

1.5

1.0

1.0

0.5

0.5
0.00

0.0
0

500

1000

1500

2000

500

1000

1500

2000

Time (sec)

Time (sec)

J. Membr. Biol. 179, 2001/Biochem. Pharmacol. 67, 2004

Señal de calcio y especies reactivas de oxígeno

CCK-8 1 nM+ (FCCP+TPS) 0.5 µM+H2O2 1 mM

2.0

1.5

150
140

1.5

[Ca ]o
F530

2+

F340/380

1.5

1.0

1.0

1.0

0.5

0.5

CCK-8+TPS

CCK-8 1 nM...