beca col

Miguel Barberà Solà
Rubén D. Artero

PROYECTO DE COLABORACIÓN: Implicación de la adhesión celular al sustrato en la ruta de patogénesis de DM

Introducción

Se ha demostrado que los transcritos portadores de expansiones del trinucleótido CUG (plegadas en horquillas; ds(CUG)n) son suficientes para desencadenar Distrofia Miotónica (DM) en ratones. Estas horquillas unen las proteínas humanasMBNL1, MBNL2 y MBNL3 (referidas genéricamente como Muscleblind, su ortólogo en Drosophila) tanto in vitro como in vivo, secuestrándolas de su función normal. El knock-out de Mbnl1, así como el fenotipo de moscas mutantes muscleblind, apoya que la falta de función de MBNL en humanos es el desencadenante principal de la DM. Sin embargo, experimentos en cultivo celular y un modelo de DM enDrosophila que expresa 162 CUG indican que el secuestro de MBNL es una etapa necesaria para desencadenar DM, pero no suficiente para provocar defectos moleculares característicos de DM. Nuestra hipótesis es que el secuestro de proteínas Muscleblind en las horquillas ds(CUG) reduce la concentración efectiva de estas proteínas y sensibiliza la célula a alteraciones moleculares adicionales con un efecto sobrela función muscleblind. Para demostrar esta hipótesis proponemos identificar nuevos componentes en el mecanismo de patogénesis utilizando un modelo de DM en Drosophila, desarrollado en nuestro laboratorio, por expresión de 480 CTGs bajo el control del sistema Gal4/UAS. Utilizando estos datos previos, y otras hipótesis, planteamos como objetivos de este proyecto analizar la implicación en la rutade patogénesis de la DM en la adhesión celular al sustrato. Para comprobar la posible alteración en las propiedades adhesivas de las células que expresan repeticiones, estudiaremos la integridad de las membranas basales del epitelio del disco imaginal de ojo, la polaridad apico-basal de los fotoreceptores y la activación de la apoptosis en discos que expresan CUGs.

Objetivos y plan de trabajoNuestros resultados previos con el modelo de DM en Drosophila sugieren que la adhesión de las células del disco de ojo, un epitelio, puede estar alterada. En concreto, reducir a la mitad la dosis de Viking, el gen codificante para la cadena 2α del colágeno tipo IV (el componente estructural mayoritario de las membranas basales de los epitelios), potencia fuertemente el fenotipo rugoso de lasmoscas modelo. Aunque existen otras alternativas, nuestra hipótesis de trabajo es que la falta de función de muscleblind, inducida por las repeticiones CUG, interfiere con la función de las integrinas las cuales son un componente esencial para el anclaje de las células a los epitelios.También implicadas en adhesión celular están las proteínas Fear of intimacy (migración) y Coro (implicada en elcitoesqueleto de actina). La primera actividad dentro de este objetivo persigue obtener evidencia directa de alteraciones en proteínas implicadas en adhesión en las moscas modelo. La segunda intenta avanzar en la implicación de las integrinas en este fenotipo.

A.Detección de alteraciones en distintas moléculas de adhesión celular, y marcadores de polaridad celular, en ojos rugosos por expresión derepeticiones CUG

Para la consecución de este objetivo compararemos primero un panel de marcadores de adhesión celular en moscas normales y que expresan las repeticiones CTG en el disco imaginal de ojo. Las tinciones se realizarán utilizando discos de larvas de tercer estadío y siguiendo técnicas estándar en inmunohistoquímica. Comprobaremos la integridad de la membrana basal de los discosimaginales de ojo que expresan repeticiones CUG. Se utilizarán anticuerpos específicos contra proteínas constituyentes de las membranas basales tales como colágeno IV, laminina, tenascina, nidogenina y fibronectina, entre otras. Esperamos encontrar alteraciones en el nivel de expresión de alguno de estos componentes o, alternativamente, alguna alteración morfológica en la membrana basal del...