Biologia Molecular

1.5. Mètodes d’aïllament, purificació i seqüenciació d’àcids nucleics.

Enzims de restricció: Endonucleasas, enzims que tallen el DNA pq reconeixen seqüéncies específiques .

Tipus I: Reconeixen una seqüencia i tallen a l'atzar una kb cap al extrem 5' o 3'
----------------------------------

Tipus II: Reconeixen una seqüencia i tallen la seqüencia
Tipus III: Reconeixen una seqüencia itallen 20-25 pb enllà
La diferencia entre els ezims de tipus I i III és que en el de tipus tres la distancia esta definida no és a l'atzar. En canvi les de tipus II els extrems de totes les molècules tallades seran iguals. Per això normalement s'utilitzen les de tipus II.
Les seqüencies reconegudes per els enzims de restricció són palindromiques

Maneres de tall sobre tipus II
Tallen en elpunt central de la seqüencia que reconeix.Com a resultat es crean extrems roms (extrems igual)
------ACG CGT------
------TGC GCA-----
Tall no central, concretament en un dels extrems, això crea extrems cohesius, son iguals poden aparellar-se. Si tinc un DNA amb diversos extrems cohesius tots seran iguals i podran aparellar-se
---------A CGCGT------
---------TGCGC A------Noms del ER: Estan formats per 3 lletres i un numero

EcoR1

BamH1 Eco, Bam Hind, indiquen de quin organisme s'ha extret l'ER
Hind (III) A partir d'un organismes podem tenir més d'un enzim (R1,H1...)
Dianes de resticció: 3,4,6,8, bases, les més utilitzades són les de 6 pb

Hi ha enzims de restricció que reconeixen la mateixa diana, però no tallen el mateix lloc.
Exemple 1:GGATCC, és reconeguda per Acc651 i per Kpn1. Acc651 deixa el extrem monocatenari 5' i l'altre enzim deixa l'extrem monocaternari 3'.
Kpn1:5' ---GGATC C---- 3' Acc651: 5' ---G GATCC---- 3'
3' ---C CTAGG---- 5' 3' ---CCTAG G---- 5'
Aquests enzims s'anomenen ISOQUIZÒMERS:enzims de restricció diferents que reconeixen la
mateixa seqüència de bases però donen diferent ruptura o bé tenendiferent punt de metilació.

Exemple 2: BamH1 G GATCC Bgl II A GATCT
CCTAG G TCTAG A
Els extrems cohesius que es generen son complementaris tot i que els enzims tenen dianes diferents. Aquest enzims de restricció s'anomenen isocoudòmers.

DNA lligasa: unió de segments.Catalitza la formació d’un enllaç fosfodiéster entre
----------------------------------
grup fosfat en 5’ iihidroxil en 3’.

La fosfatasa alcalinasa: Desfosforila el DNA, els grups fosfats dels extrems 5' de la molecula de DNA
Polinucleotid quinasa: Introdueix grups fosfats, requereix ATP per produir-se el procés-
Deoxinucleotidil transferasa terminal: Adiciona dNTPs a l’extrem hidroxil 3’ de ss o dsDNA, és a dir afegeix a l'atzar al extrem 3' hidroxil d'un DNA.
----------------------------------DNA Polimerasa I: Copia DNA utilitzant una cadena de DNA com a motlle.
Afecta activitat 5'-->3' polimerasa
Afecta activitat 3'-->5' exonucleasa
----------------------------------

Fragment Klenow: Molecula derivada de la polimerasa la qual se li ha tret un tros de gen que li dona activitat 3'--> 5' exonucleasa. S'utilitza per remplenar extrems cohesius per donar extrems roms.Taq polimerasa: Aillada de termus aquaticus (geiser) viu a 95ºC . És termorresistent, no és desnaturalitza. S'utilitza per fer la reacció de la PCR. (técnica per obtenir gran quantitat de DNA a partir de dos encebadors)
RNasa A: Netejar RNA d'una mostra de DNA
Rnasa H: Degrada RNA quan es troba hibridat el DNA
Dnasa 1: endonucleasa, degrada DNA a l'atzar. Pot utilitzar Magnesi o Manganés (cationsdivalents). En el manganés el Dnasa talla la cadena per al mateix punt, en canvi el magnesi talla per llocs diferents, creant una cadaena de DNA amb una serie de osques, segments en el DNA.

Nucleasa S1: Degrada RNA i DNA monocatenari, s'utilitza per convertir segments cohesius en segments roms.

Metodes d'aillament i separació del DNA
Tipus de DNA:
DNA genomic eucariota: Molt complex...