Biologia

Laboratorio de Biología Molecular
Extracción de DNA plasmídico: “Miniprep”
Introducción
Las bacterias pueden contener moléculas de DNA extracromosomales llamados plásmidos. Los
plásmidos son pequeñas moléculas de DNA circulares que son independientes al cromosoma de la
bacteria. Gracias a las técnicas de biología molecular, podemos generar plásmidos que contengan los
genes que queremosanalizar.
Los estudiantes de la licenciatura de Ciencias Agrogenómicas están llevando a cabo un proyecto de
biología molecular cuyo objetivo es aislar genes involucrados en el desarrollo de flores de la planta.
Estos genes se introducirán en plantas para sobre producir las proteínas involucradas en floración. Se
espera que las plantas que sobre produzcan estas proteínas en altos númerosdesarrollen más flores.
Durante el proyecto se requiere clonar los genes de floración en plásmidos. Los plásmidos son
introducidos en bacterias para poder multiplicarlos. Las bacterias sirven como “fábricas” de plásmidos
que nos permiten obtener cantidades manejables de los plásmidos para poderlos utilizar en las distintas
técnicas de laboratorio. Para extraer los plásmidos de las bacterias se utilizala técnica de lisis alcalina.
A la fecha, estamos analizando las bacterias que contienen los plásmidos con los genes de interés. Es
necesario identificar aquellas bacterias que tienen los plásmidos con los genes que buscamos. Para ello,
se requiere utilizar la técnica de extracción de DNA plasmídico y posteriormente analizar el DNA en geles
de agarosa.
Lecturas recomendadas:http://askabiologist.asu.edu/alkaline-lysis
PROTOCOLO
Material
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Medio Luria Broth (LB)
Kanamicina 50 mg/mL
Cajas Petri con medio LB Kan50
Etanol y H2O estéril
Micropipetas, tubos y puntas

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Birnboim I: 50 mM glucose, 10 mM
EDTA 25 mM Tris pH 8.0
Birnboim II: 0.2 N NaOH, 1% SDS
Birnboim III: 60 ml 5M KOAc, 11.5 ml
96% ácido acético, 28.5 ml H2O

Parte I. Manejo de Micropipetas
En unlaboratorio de biología molecular, es necesario utilizar volúmenes en la escala de microlitros. En
un litro hay 1 millón de microlitros (µL), en un mililitro (mL) hay 1000 microlitros. Para poder medir estos
volúmenes tan pequeños es necesario utilizar micropipetas. En tu banca hay tres diferentes
micropipetas:
1. p1000: se utiliza para tomar volúmenes de 100 µL a 1000 µL. Utiliza las puntas azules.2. p200: se utiliza para tomar volúmnes de 20 µL a 200 µL. Utiliza las puntas amarillas.
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3. p20: se utiliza para tomar volúmenes de 2 µL a 20 µL. Utiliza las puntas amarillas.
¡Es MUY importante no tomar volúmenes más grandes o más pequeños de los indicados!
Antes de comenzar es importante familiarizarnos con las pipetas.
1. Las pipetas siempre se deben de utilizar en posición vertical.2. El primer paso es poner una punta en la pipeta.
3. Ajustar el volumen que se desea medir.
4. El botón para tomar el líquido tiene dos posiciones.
a. Hay que presionar el botón con el dedo pulgar hasta el primer tope antes de introducir
la punta al líquido.
b. Introducir SOLO 2-3 mm de la punta al líquido.
c. Soltar LENTAMENTE el botón para que suba SUAVEMENTE.
d. Para soltar el líquido,nuevamente hay que presionar el botón LENTAMENTE hasta el
primer tope y poder expulsar el líquido. Para sacar el líquido restante se presiona el
botón hasta el segundo tope. Soltar LENTAMENTE el botón.
e. Quitar la punta con el botón de expulsión.
5. Cada integrante del equipo deberá practicar tomar y soltar agua utilizando una de las pipetas.
Parte II. Inoculación de medio con las coloniasde Escherichia coli + Plásmido con producto de PCR
Esta parte la realizarán tus instructores UN día antes de la práctica de laboratorio.
1. Inocular 3 mL de LB Kan50 en tubos de 15 mL con una colonia de E. coli.
2. Incubar los tubos a 37o C en agitación toda la noche.
Parte III. Extracción de DNA utilizando la técnica de lisis alcalina de Birnboim y Doly.
1. Verifica que tu cultivo haya...