Biologia

17.- Electroforesis de ácidos nucleicos en geles
de agarosa. Aislamiento y caracterización
electroforética de DNA plasmídico
Carmen Alicia Padilla Peña, Jesús Diez Dapena, Emilia Martínez
Galisteo, José Antonio Bárcena Ruiz, Concepción García
Alfonso
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

Laelectroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar
y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de
diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en
gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesisse aplican marcadores
de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede
calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En esta práctica, se
pretende que el alumno comprenda el fundamento teórico de esta técnica
y sus aplicaciones, llevando a cabo la separación electroforética en gel de
agarosa de DNA plasmídico que el mismo alumno va a aislar y purificar a
partir de uncultivo bacteriano. Se han desarrollado un gran número de
métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos
ellos implican invariablemente tres pasos: crecimiento de la estirpe
bacteriana portadora, recogida y lisis de las bacterias y purificación del
DNA plasmídico. A continución, el DNA aislado se puede analizar
mediante electroforesis en gel de agarosa.
Palabras clave:ácidos nucleicos, electroforesis, gel de agarosa, marcadores de
peso molecular, plásmidos.
Abreviaturas empleadas. DNA: ácido desoxirribonucleico; LB: Luria-Bertani;
SDS: dodecil sulfato sódico; TBE: Tris-borato-EDTA (etilen-diamino
tetraacético); UV: luz ultravioleta.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula
cargada bajo lainfluencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas
importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos,
ácidos nucleicos…) poseen grupos ionizables y existen en solución como
especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies
cargadas se van a separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje
a través de los electrodos. Existen muchos tiposde electroforesis, que se
engloban en dos categorías fundamentales:
1

-Electroforesis de frente móvil.
-Electroforesis de zona.
Actualmente, sólo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra
se desplaza sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel
(agarosa, acrilamida…) y los componentes de la muestra migran en forma de
pequeñas bandas, también llamadaszonas.
La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas
o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes
para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como la
poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma,
las moléculas de DNA o RNAsometidas a electroforesis se desplazarán al polo
positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en
función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van
a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida
por cada fragmento de DNA va a serinversamente proporcional al logaritmo de
su peso molecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño
conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras
de DNA problema.
En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio,
sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se
ilumina con luz ultravioleta. Tras la...