Biooooo Enz

Práctico de Bioquímica



CBCC1- Práctica 1: Estudio de una actividad enzimática











Grupo: B12 - A
Integrantes: Daniela Da Luz, Camila Paleo, Andrea Razquin, Lucía Rodríguez
Objetivos:
a) Evaluar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial de una reacción catalizada.
b) Determinar los parámetros cinéticos (Km y Vmax) de la invertasa de la levadura.

Procesamientoy análisis de datos
Para determinar la actividad enzimática de la invertasa seguimos el procedimiento establecido en la Guía de Práctico. Luego de realizado esto, pasamos a medir la Absorbancia en el Espectofotrómetro; dato que posteriormente usaríamos para calcular la concentración de Glucosa en el sustrato. Así obtuvimos la siguiente tabla:
Tubo
[Sacarosa] (mM)
Volumen sacarosa 400 mM (μM)Volumen Buffer (μL)
Volumen Invertasa (μL)*
Absorbancia (U.A.)
Blanco
0
0
900
100
0
1
10
25
875
100
0,125
2
20
50
850
100
0,215
3
50
125
775
100
0,337
4
100
250
650
100
0,106
5
300
750
150
100
0,052
6
400
900
0
100
0,297

Los valores de absorbancia obtenidos del tubo B2 fueron despreciables, por los que no los incluimos en el desarrollo.
Luego seguimos el procedimiento para obtener la Curva deCalibración. Con los datos de la tabla, calculamos la concentración de Glucosa.
Tubo
Glucosa 10 mM (μL)
H20 (μL)
DNS (mM)
[Glucosa](mM)*
Abs 570nm (U.A.)
B
 
100
0,9
0
0 
1
20
80
0,9
2
0,037
2
40
60
0,9
4
0,106
3
60
40
0,9
6
0,163
4
80
20
0,9
8
0,215
5
100
- 
0,9
10
0,235

*La concentración de la Glucosa la obtuvimos mediante la siguiente ecuación:
Molaridad Inicial x Volumen Inicial = Molaridad Final xVolumen Final
Si despejamos la ecuación nos queda que:
Molaridad Final = Molaridad Inicial x Volumen Inicial
Volumen Final

Ejemplo: Tubo 1

M. Final = 10 mM x 20 μM = 2mM
100 μM


Con los datos obtenidos, graficamos la Curva de Calibración:



A partir de esta gráfica calculamos la pendiente, la cual nos permite obtener ε (coeficiente de extinción, característico de cada sustancia).

ε= Pendiente = ΔAbsorbancia = 0,1 – 0.05 = 0,05 = 0,025 mM-1.cm-1
Δ [Glucosa] mM 4,0 -2,0 2,0

Observamos que este cálculo es correcto al compararlo con el coeficiente a de la ecuación de la línea de tendencia, en la cual a=0,025.

Luego de obtener ε, procedemos a calcular la Concentración de la Glucosa para cada tubo, a partir de laecuación de Lambert y Beer.

Absorbancia= ε x l x C

Donde l es el ancho de la celda del espectofotómetro y C la Concentración de Glucosa.

De esta ecuación observamos que la concentración es directamente proporcional a la Abosrbancia, es decir, a mayor absorbancia, mayor concentración y por ende menos luz llega al detector.

Despejamos la Concentración de la ecuación de Lambert y Beer y obtenemosque:

C = Absorbancia
ε x l

Ejemplo: Tubo 1

C = 0,125 U.A. = 5 mM
0,025 mM-1.cm-1 x 1 cm


En este caso, al ser 1 el ancho de la celda del espectofotómetro, no va a afectar en la ecuación.

Utilizando la concentración de la Glucosa, calculamos la Vo para cada tubo, mediante la siguiente ecuación:

Vo= Δ[Glucosa]
Δtiempo
Esta ecuación se deduce del gráfico [Glucosa] (que es el producto) en función de tiempo. Como estamos en situación de velocidad inicial (es decir, menos del 10% de sustrato se consumió) este gráfico es una recta, por lo que su pendiente es única. Gracias a esto no es necesario realizar la práctica a diferentes tiempos sino que solamente con calcular la concentración de Glucosa a los 15 minutos,ya podemos obtener la pendiente, porque

Δ[Glucosa] = [Glucosa]f – [Glucosa] i
Δ tiempo tf - ti

Donde: [G]f = 5 mM
[G]i= 0
Tf= 15 min
Ti= 0

Entonces:

Vo= 20* mM = 1,33 mM/min
15 min

*Cabe destacar que la concentración de Glucosa que habíamos calculado anteriormente era sin tener en cuenta la dilución (diluimos todos los tubos con 3mL de DNS,...