Bioquimica

PRACTICA N* 04
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZEMATICA
INTUDUCCION:
La cinética enzimática es la parte de la Enzimología que se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las causas de su variación. Los ensayos enzimáticos se emplean rutinariamente en muchos laboratorios clínicos para el diagnóstico de numerosas enfermedades, bien observando velocidades dereacción anormales o bien observando niveles enzimáticos inadecuados en el plasma u otros tejidos.
Un ensayo enzimático se basa en la actuación de la enzima sobre una sustancia, llamada sustrato, catalizando su conversión en otra específica, conocida como producto. Normalmente algún elemento de los que intervienen en la reacción absorbe luz a una longitud de onda determinada, con lo que lareacción puede seguirse por colorimetría o espectrofotometría.
OBJETIVOS:
Determinar los principales factores que tienen que ver con la cinética de las enzimas.

MATERIALES:
Almidón 4gr. | | Amilasas (frutenzima) | |
Ácido clorhídrico 0.1 N | | Solución yodada | |
Espectrofotómetro | | Tubos de ensayo | |
PROCEDIMIENTO:
OBTENCION DE FACTOR DE CONVERSION:
* En factor de conversiónse obtiene a partir de la curva de calibración, que se describe.
COMPONENTES | Blanco | Estándares |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Almidón bufferado (ml) | - | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 |
Agua destilada (ml) | 3.0 | 2.5 | 2.0 | 1.5 | 1.0 | 0.5 |
Mezclar |
HCI 0.1 N | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
Mezclar |
Solución yodada (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |

*Mezclar por inversión y dejar reposar por 5 minutos.
* Hacer la lectura en espectrofotómetro a 600 nm haciendo cero con agua destilada.
* Calcular el factor de calibración mediante la siguiente formula:

LOS PASOS DE LA MEZCLA:
1. Preparar 6 tubos numerados, agregando en cada uno de ellos Agua destilada, almidón bufferado, en forma ascendente. Ahora, mezclar cada uno de los tubos deensayo.
2. Al momento en que almidón y agua destilada entren en contacto después de la mezcla aumentar sucesivamente a todos los tubos de ensayo el ácido clorhídrico para después hacer la mezcla.
3. Se debe mantener los tubos de ensayo en las gradillas para después hacer la mezcla finalmente con la solución yodada (lugol) de 0.5 ml respectivamente.
4. Finalmente, cuando esténtodos los tubos listos se agitan para mezclar el reactivo añadido respectivamente.
5. Luego dejar reposar los tubos a temperatura ambiente, luego se separan en cubeta tanto el reactivo blanco y los estándares de 1 hasta 5 para su lectura en espectrofotómetro a 600 nm. Procediendo con el contenido de la cubeta en blanco se pone a cero en el espectrofotómetro para después haciendo cambio decubeta con el reactivo cuyo material presenta un mínimo de absorbancia uno y hacer la lectura respectiva, el mismo procedimiento se aplicó para los demás reactivos hasta el reactivo cinco del tubo de ensayo.
Las mismas soluciones fueron utilizadas en ambos procedimientos experimentales.
EVALUACION DE LA ACTIDAD ENZIMATICA:
* Evaluar la actividad enzimática por método de Stret – Close modificado( cueva y col., ) de acuerdo a la siguiente esquema:
COMPONENTE | Enzima | Testigo | Blanco |
Sustrato bufferado(ml) | 2.5 | 2.5 | - |
Agua destilada | 1.0 | 1.4 | 3.0 |
Incubar 5 minutos en baño de maría a 37 ˚C |
Enzima (ml) | 0.5 | - | 1.0 |
Incubar 5 y 15 minutos en baño de María a 37 ˚C |
HCI 0.1 (ml) | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
Enzima (ml) | - | 0.1 | - |
Solución yodada (ml) |0.5 | 0.5 | 0.5 |
* Mezclar los tubos por inversión. Dejar reposar 5 minutos y leer las absorbancia en espectrofotómetro a 660 nm entre 10 y 30 minutos.
1. Aplicamos los diferentes reactivos en cada uno de los tres tubos de ensayo tanto en la enzima, testigo y blanco. Poniendo particular cuidado en las VARIACIONES de concentración de Sustrato.
2. Se añade sustrato bufferado y agua...