Bioquimica

PRACTICO 2
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVO:

1. Conocer diferentes métodos para cuantificar proteínas
2. Determinar espectrofotométricamente la concentración de proteínas (BSA: Albúmina de suero de bovino) utilizando método e Lowry.

Requerimiento para los alumnos: Papel milimetrado regla y calculadora


INTRODUCCION

En general, no hay método completamente satisfactorio paramedir la concentración de proteínas en una muestra. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de los otros componentes, de la rapidez y sensibilidad deseada. Los métodos que se usan corrientemente para medir concentraciones de proteínas son Método de Lowry, Método de Biuret, Método de Bradford y otros como el del Ácido Bicinconinico

• Metodo de Lowry:

Es un métodocolorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A las muestras se le añade un reactivo que forma un compuesto coloreado con las proteínas, siendo la intensidad del color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert y beer.
Algunos aminoácidos sufren reacciones característicos con ciertos reactivos debido a la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchasreacciones de este tipo se caracterizan por la formación de productos coloreados. La tirosina por ejemplo, debido a su grupo hidroxifenilo, reacciona con una solución de ácido fosfomolíbdico tungstico (Reactivo Folin-ciocalteau, color amarillo) en un medio cúprico alcalino, produciendo una coloración azul, que absorbe a 650 nm.

El método consta de dos etapas:
1.- Reacción previa de la proteína enmedio alcalino con iones Cu2+. Los iones Cu+2, presentes en el reactivo de cobre alcalino RCA, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídico. Esos complejos Cu+2 - proteína tiene un color azul claro. Además provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenolitos de tirosina que van aparticipar en la segunda etapa de la reacción.
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2.- Reacción de reducción del reactivo de Folin-ciocalteau, esta ocurre en un medio alcalino, al oxidarse los grupos fenolitos de los residuos de tirosina, presente en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador.
El principal constituyente del reactivo de Folin-ciocalteau es el acidoFosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolitos da lugar a un complejo de color azul intenso.


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Sin embargo, debido a las diferencias en el contenido de tirosina de una proteína a otra, cantidades iguales de proteínas distintas, producen coloración diferente con el reactivo de Lowry, motivo por el cual no es posible obtener la concentración realde una muestra de proteína por este método, aún así, cuando se requiere una estimación relativa de la concentración de proteínas, este método es ampliamente satisfactorio, debido a su alta sensibilidad. Sensibilidad de este método es de 10 (gr de proteínas por ensayo.


OTROS METODOS UTILIZADOS

• Método de Biuret:
Los componentes de la muestra a estudiar que tenga dos o más unionespeptídicas (por ejemplo: tetrapéptidos, polipéptidos y proteínas) dan color púrpura característico cuando se tratan con solución de sulfato de cobre diluida.
El color se debe aparentemente al complejo de coordinación de Cobre con cuatro átomos de N que forman los enlaces peptídicos (este complejo se puede forman como mínimo con tres grupos NH de los enlaces peptídicos), ubicados a una determinadadistancia. Este método es reproducible para una proteína, pero requiere grandes concentraciones de proteínas para la formación de color.
La sensibilidad del método es de 0,25 – 200 mg de proteínas por ml de solución.

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Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)

Método de Bradford: (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), está basado en el cambio de color del colorante Coomassie...