Biotecnologia

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGIA LABORATORIO DE DESTREZAS III ELECTROFORESIS DE FIBRINÓGENO EN GELES DE POLIACRILAMIDA I. OBJETIVOS 1. 2. 3. Entender los principios básicos de SDS-PAGE. Separar proteínas presentes en una muestra estándar. Determinar el peso molecular las cadenas de la proteína fibrinógeno.

II.

INTRODUCCIÓNPara realizar una electroforesis de proteínas se utiliza como soporte un gel de poliacrilamida. Esta técnica es ampliamente utilizada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. Permite separar las proteínas en sus subunidades o cadenas polipéptidos individuales, a base de su carga eléctrica o masa molecular. Esta técnica es rápida y económica a nivel de muestra pues se requiere solomicrogramos de proteína. Algunas características de la electroforesis en geles de poliacrilamida son: 1. Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida (monómero) y bisacrilamida (agente entrecruzador, cross-linker). El tamaño de los poros de los geles a través de los cuales migran las proteínas depende del % de acrilamida / bisacrilamida utilizado. 2. Para polimerizar el gelde acrilamida y bisacrilamida se utiliza TEMED (N,N,N,N’-tetrametilnediamina) y persulfato de amonio (APS). 3. La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración y volumen de persulfato de amonio (catalizador) y TEMED (iniciador). 4. El oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Por lo tanto, se debe evitar la formación de burbujas en el gel. Para esto se utiliza 95% deetanol y la peinilla. Factores que afectan la velocidad de migración: 1. Carga de la muestra- La velocidad de migración aumenta cuando hay un incremento de la carga neta. Generalmente, la magnitud de la carga depende del pH. 2. Tamaño - La velocidad de migración es menor en las moléculas o polipéptidos grandes debido al incremento de las fuerzas de fricción ejercidas por el medio circundante.

3.Forma - Las moléculas de tamaño similar pero con diferentes formas exhiben distintas características migratorias. 4. Voltaje - El voltaje regula la corriente y, por lo tanto, la velocidad de migración es proporcional a la diferencia de potencial existente. Mayor voltaje mayor es la velocidad de migración. 5. “Buffer” de electroforesis - Determina y estabiliza el pH del gel afectando la velocidad demigración de las moléculas. SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrilamide gel electrophoresis, es la electroforesis de proteínas más ampliamente utilizada. Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante. Las proteínas son desnaturalizadas antes de correr la electroforesis. Para esto se aplica a las muestras calor (90-95oC del heat block ) y agentes químicos como SDS y mercaptoetanolpresentes en el Laemmli Buffer o simple buffer. El SDS es un detergente aniónico que le da carga negativa a la proteína. Además afecta su plegamiento (folding), su estructura secundaria (alfa hélice, betaplegada) y terciaria (enlaces e interacciones). El β-mercaptoetanol, rompe los puentes disulfuro de la proteína alterando también la estructura secundaria y terciaria de la proteína. De esta formase obtiene cadenas polipéptidos lineales y con carga negativa. El calor contribuye al rompimiento de los puentes de hidrógeno afectando también la estructura secundaria y terciaria. Los geles utilizados en esta técnica son el Stacking gel (gel de apilamiento) y el Separating gel (gel de separación). El Stacking gel asegura que las proteínas se acomoden correctamente. Este gel tiene poros de mayortamaño debido al porcentaje menor de acrilamida/ bisacrilamida (4%) y tiene un pH de 6.8. El Separating gel permite la separación de las cadenas polipéptidas de las proteínas debido a que sus poros son de menor tamaño. Esto a su vez es debido al porcentaje mayor de acrilamida/ bisacrilamida (10%). Su pH es de 8.8. Cuando se caracteriza una proteína de una muestra es recomendable correr más de un...