Caracterización Estructural de FcXTH

CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE FcXTH


IV. RESUMEN

La frutilla chilena (Fragaria chiloensis) surge como una nueva alternativa comercial, debido a sus excelentes características organolépticas y hortícolas, destacando la tolerancia que presenta frente a diferentes tipos de estrés y resistencia a enfermedades y pestes. Su fruto es perecedero, de rápido ablandamiento, reflejado en laalteración de la textura del fruto, que influye negativamente en la sobrevida de postcosecha y calidad del mismo, limitando así, su comercialización. Estudios previos han demostrado que el ablandamiento esta relacionado con la modificación de la pared celular, lo que corresponde a una serie de modificaciones de los polisacáridos que la componen. Los xiloglucanos (XG), polisacáridos abundantes en lapared celular, entrecruzan las microfibras de celulosa otorgándole rigidez a la pared. Se piensa que la modificación de las cadenas de XG estaría involucrada en la alteración observada en la pared, lo que resulta en el ablandamiento del fruto.
La enzima xiloglucano endotransglicosilasa / hidrolasa (XTH) presente en todos los tejidos vegetales, presenta alta afinidad a xiloglucano y posee actividadendotransglicosilasa (XET), endohidrolasa (XEH), o ambas. En F. chiloensis se han identificado dos genes, que presentan alta similitud de secuencia con miembros de la familia de las XTH, pertenecientes a grupos filogenéticos distantes y con organización genómica diferente. Fc-XTH1, presenta un perfil de expresión y alta acumulación de transcritos especialmente en fruto y Fc-XTH2 relacionado conlos procesos vegetativos como el crecimiento de hojas, pues elevados niveles de transcritos son observados en estos tejidos.
Con el fin de aportar nuevos antecedentes en el proceso de ablandamiento del fruto, y obtener una perspectiva sobre el mecanismo de acción a nivel molecular de las enzimas FcXTH1 y FcXTH2, se empleó la metodología de modelado comparativo para construir las estructuras delas enzimas, que se validaron y refinaron con simulaciones de dinámica molecular. Los modelos obtenidos presentan estructuras similares que comprenden 15 β-hojas y 2 α-hélices. Además, el motivo catalítico HDEIDFEFLG está orientada hacia la cavidad central en las dos estructuras. Un sitio de N-glicosilación está presente en cada proteína, pero la posición en la estructura es diferente: el segmentoTRN en FcXTH1 es contigua al sitio activo mientras que el segmento de NGS en FcXTH2 se encuentra 15 residuos hacia el C-terminal. Además, se exploró la interacción de un conjunto de putativos sustratos xiloglucano (XG) con la proteína, usando simulaciones de acoplamiento molecular. Ambas enzimas mostraron energías favorables de afinidad para sustratos XG, sin embargo, la estabilidad del complejodepende del estado de glicosilación de FcXTH. Simulaciones de dinámica molecular evidenciaron claramente una marcada estabilidad de ambas proteínas al estar glicosiladas con 9 manosas (9m). Sin embargo, la afinidad en FcXTH1, glicosilada o no, varia de acuerdo al sustrato, mientras que FcXTH2 al estar glicosilada, presentó una marcada preferencia por los dos sustratos evaluados, XXXG y XXFG. Estosdatos fueron corroborados por los resultados arrojados por MM-GBSA. Por otro lado, la estabilidad de los sutratos en la hendidura de las proteína esta dada por un conjunto de residuos posicionados en los loops de las estructuras proteicas, residuos que en su mayoría se encuentran conservados en la familia de la GH16. Los datos son congruentes con un probable papel de XTH durante el desarrollo ymaduración del fruto.














V. ABSTRACT

The chilean strawberry (Fragaria chiloensis) appears as a new commercial alternative, due to its excellent organoleptics and horticultural characteristics, highlighting the tolerance that presents in response to different kinds of stress and resilience to plagues and diseases. Its fruit is perishable with fast softening, it is...