centifugacion

Roux's Arch Dev Biol (1988) 197: 360-365
CENTRIFUGACION DE EMBRIONES DE DOS CELULAS DE RATON: ESTRATIFICACION Y RECUPERACION DEL CITOPLASMA
Verónica Téllez, Ariel Ahumada, Juan Muro*, Soledad Sepúlveda, y Luis Izquierdo
Departamento de Biología, Universidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile
*Dirección Actual: Departamento de Biología, Universidad de Trujillo, Apartado 02, Trujillo,Perú.


RESUMEN: Dos células de embriones de ratón, que se centrifugaron durante 1 h a 70000 - 90000 (revoluciones x gravedad), mostraron una estratificación precisa del citoplasma y un alargamiento del núcleo. Los óvulos eran fijos en diferentes momentos y observados por microscopía de luz y en el electrónico utilizando métodos citoquímicos y extractos de detergente. 40 minutos después de lacentrifugación el aspecto morfológico normal fue recuperada excepto el casquete lipídico en los polos centrípetos de los blastómeros .La división, compactación y blastulación no fueron alterados por centrifugación. Además se realizó tratamientos con colcemid o Citocalasina D los cuales retrasan pero no impiden la recuperación. Estos resultados sugieren que una estructura citoesquelética puede estarinvolucrada en este tipo de regulación embrionaria.
PALABRAS CLAVES: Óvulos de ratón, centrifugación, regulación, citoesqueleto.

INTRODUCCION
Dos células de embrión de ratón, observados por inmunofluorescencia, muestran una regionalización de miosina (Sobel 1983 a, b), fodrin (Schatten el al., 1986) y Espectrina (Sobel y 1985 Alliegro, pero véase Damjanov el al. 1986). La etapa de 4 célulaspresenta regiones progresivas de fosfatasa y 5' nucleotidasa activa observada en la membrana de la célula (Izquierdo el al. 1980; Izquierdo y Ebensperger 1982). Las distintas regiones han sido reconocidas anteriormente .En el ovocito o en el óvulo fecundado, que puede ayudar a establecer un linaje de la célula que une blastómeros tempranos con las células diferenciadas de blastocitos. Además, soncapaces de regular y desarrollar blastocitos normales con embriones experimentalmente alterados (ver comentarios por Izquierdo 1977, 1986, Johnson et al. 1984). Estas observaciones, sin embargo, no excluyen la existencia de una estructura espacial oculta que puede determinar el desarrollo, aunque dicha determinación podría anularse por regulación embrionaria. Aquí analizamos la estructura espacial de2 células embrionarias de ratón mediante la centrifugación y posterior cultivo in vitro. No se ha utilizado este método en los mamíferos (excepto un interesante informe de la investigación preliminar por Mulnard, 1970).

MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de embriones: Dos células de embriones se colectaron en medio biggers (Biggers et al., 1971) suplementado con 4 mg/ml suero de albumina debovino (BSA) (Calbiochem), para la superovulacion de ratones se infiltro a hembras de la cepa CF 1, se le inyectó hormonas PMS y HCG, 36 h después se asumió el tiempo de ovulación (Sepúlveda Ie al. 1985)
Procedimiento de centrifugación: Se prepararon soluciones de dextrano (Sigma 40000 MW) en medio de Biggers en concentraciones de 17%, 15%, 13% y 11% (w/v), gasificados por separado con C02, asi comoel ajuste de pH a 7.2-7.4 y luego introducidos secuencialmente en tubos de nitrocelulosa 0,8 mL. Los embriones fueron colocados en capas con altas gradientes discontinuas y los tubos se centrifugaron durante 60 min usando el rotor 39 SW de una centrifugadora de modelo Beckman, de cabeza móvil . Las fuerzas centrífugas aplicadas oscilaron del 15000 a 120000 x g. La temperatura del contenido del tubovarió entre 13 y 18 ° C, con excepción de experimentos en los que se llevó a centrifugación en a 4 º C.
Cultivo in vitro: Tras la centrifugación los óvulos fueron enjuagados con medio de Biggers y cada uno fijado inmediatamente o cultivadas para diferentes tiempos antes de la fijación. Los embriones fueron cultivados en microgotas del medio Biggers con BSA en platos de Petri de plástico...