citometria de flujo

Introducción a la Citometría de Flujo
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MODULO IV
Adquisición de datos en el Citómetro
4-a Preparación de la muestra
4-b Adquisición de la muestra-Gráficos para la adquisición
4-c Calibración y Compensación
4-d Protocolo para la compensación manual
4-e Amplificación Lineal y Logarítmica
4-f Adquisición de Células pequeñas. Umbral
4-g Compensación automática
4-hControl de alineamiento
Bibliografía

4-a Preparación de la muestra
Cuando nos referimos a adquirir, estamos hablando de hacer correr las muestras en el equipo para
registrar los resultados. Para ello, lo primero que necesitamos es la muestra procesada.
Dependiendo de lo que querramos medir en el equipo, la muestra será procesada de diferente
manera. Podemos utilizar sangre enteraanticoagulada, células separadas por centrifugación en
gradiente de densidad (Ficoll-Hypaque, Dextran), células cultivadas, líneas celulares, células
provenientes de tejidos previamente disgregados, o partículas innertes llamadas microesferas a las
cuales se les puede pegar alguna proteína de interés. Podemos estudiar leucocitos, glóbulos rojos,
plaquetas, células dendríticas, células tumorales, etc. Lascélulas pueden ser frescas o fijadas.
Podemos estudiar receptores de superficie o intracelulares. La citometría ofrece una amplia gama
de aplicaciones. Para conocer cuál es la metodología de procesamiento, se busca información en las
publicaciones, Internet, en las especificaciones (data sheet) de los productos comerciales o se
consulta con el citometrista.
A modo de ejemplo mostraremos cómo seprocede con una muestra de sangre entera anticoagulada
para estudiar receptores de superficie:
1) Utilizando un tubo para citometría (disponible en el mercado), se coloca en el fondo del mismo
la cantidad especificada por el fabricante de los anticuerpos monoclonales de interés conjugados
con fluorocromos.
2) Se agregan 100 μl de sangre homogeneizada. Se mezcla y se incuban entre 20-30minutos a
temperatura ambiente y oscuridad.
VER VIDEO EN PAGINA WEB
3) Se adicionan 2 ml de líquido de lisis (disponible en el mercado), se mezcla con vortex y se incuba
10
minutos
más
en
las
mismas
condiciones
del
punto
2.
4)
Luego
se
centrifugan
los
tubos
a
1500
rpm
durante
5
minutos.
5) El sobrenadante se extrae con bomba de agua como se muestra en el siguiente video

VERVIDEO EN PAGINA WEB
6)
Se
lava
con
2
ml
de
Buffer
Fosfato
Salino
(PBS)
7) El botón de células se resuspende en 500 μl de líquido de lectura (disponible en el mercado)
Para evaluar algún receptor intracitoplasmático habrá que permeabilizar las células después de
marcar los receptores de membrana para identificar la población y fijar.
También se puede utilizar marcación porinmunofluorescencia indirecta empleando un anticuerpo
primario específico al receptor de interés y revelar utilizando un segundo antisuero conjugado con
algún
fluorocromo.
Laboratorio de Citometría de Flujo - IMEX - CONICET - Academia Nacional de Medicina

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En el caso de usar otras aplicaciones, habrá que recurrir a la información másespecífica sobre el
tema.

4-b
Adquisición
de
la
muestra-Gráficos
para
la
adquisición
Una vez que tenemos la muestra preparada, nos acercamos al equipo para su adquisición. Debemos
colocar en la pantalla los gráficos correspondientes, plantilla que puede ser hecha en el momento o
podemos haberla armado previamente y tenerla grabada en el disco rígido. Como ejemplo vemos
la Figura 4.3Figura 4.3: Gráficos para adquisición

Luego buscamos la localización en el disco rígido donde queremos que queden grabados los datos.
Si el equipo está ya calibrado para esa aplicación, se procede sólo a adquirir. Si está calibrado para
otra aplicación, se pueden colocar las condiciones nuevas si ya las fijamos previamente y las
tenemos grabadas en el disco. Una vez finalizada esta...