Citoxianinas

Métodos de separación y caracterización de proteínas.
Evaluación del proceso de purificación.

Temario
Relación estructura - función biológica. Desnaturalización y renaturalización de proteínas; el experimento de Anfinsen. Estructuras secundarias: *-hélice, cadenas ß-paralelas y antiparalelas, giros ß. Proteínas fibrosas. Desarrollo estructural en tres dimensiones: estructura terciaria ycuaternaria de proteínas (proteínas globulares mono y multiméricas).
Métodos de separación y/o concentración de proteínas: precipitación diferencial por solventes orgánicos, sales, ácido tricloroacético, temperatura. Salting in, salting out. Importancia del pI.
Métodos de separación y/o caracterización basados en el tamaño molecular (masa/forma) o densidad de partícula. Centrifugación.Ultracentrifugación. Gradientes. Ultracentrifugación a equilibrio de densidad (densidad de flotación) y por velocidad de sedimentación. Constante de Svedberg.
Métodos de separación y/o caracterización en un campo eléctrico. Electroforesis. Principios. Separación por carga/masa o por masa. Importancia de la electroforesis como método de caracterización. Electroforesis en acetato de celulosa, poliacrilamida ypoliacrilamida en presencia de SDS. Isoelectroenfoque. Electroforesis bidimensional.
Métodos cromatográficos de separación y/o caracterización. Principios. Cromatografía de exclusión molecular (gel filtración). Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía de interacción hidrofóbica. Cromatografía de afinidad. Cromatoenfoque. HPLC (cromatografía líquida de alta presión).
Esquemasgenerales de purificación de proteínas. Objetivos de la purificación y su relación con la metodología a utilizar. Selección de la fuente biológica. Factores que pueden afectar la actividad de una proteína durante su purificación o conservación. Principios básicos en la elección de la secuencia de etapas separativas. Monitoreo durante la purificación. Concepto de actividad, actividad específica,rendimiento y purificación.

Bibliografía

“Biochemistry” (Zubay, 4ta Ed.)
“Biochemistry” (Mathews y Van Holde, 2da Ed., 3rd Ed)
“Principios de Bioquímica” (Lehninger, 2nd Ed, 3rd Ed)
“Bioquímica” (Srtyer, 4ta Ed.)
“Guide to proetin purification: a practical approach” (Deustcher)
“Practical Biochemistry” (Wilson and Walker)
“Cálculos de Bioquímica” – Segel 2ª Ed.
“Physical Biochemistry” -Freifelder 2ª Ed.
“Practical Biochemistry” – Wilson and Walker 4th Ed.

Problemas

1. Definan estructura nativa. ¿Qué conclusiones pueden obtenerse del experimento de Anfinsen?

2. La insulina posee dos cadenas polipeptídicas A y B, unidas por un par de puentes disulfuro. Además, existe un puente disulfuro interno en una de las cadenas. Cuando se desnaturaliza la insulina y se reducen suspuentes disulfuro, para luego reoxidarlos, sólo se recupera el 7% de su actividad biológica (este es un experimento similar al que realizó Anfinsen con la ribonucleasa). Este es el nivel de actividad esperado si la recuperación de puentes disulfuro ocurre al azar. ¿Porqué estos resultados contradicen las conclusiones del experimento de Anfinsen?.

3. ¿Cómo explican el efecto desnaturalizante sobrelas proteínas de a) solventes orgánicos, b) urea y c) detergentes? ¿Cómo se puede determinar si ha habido desnaturalización?

4. Se determinó el peso molecular (PM) de una proteína en distintas condiciones experimentales:

Solvente utilizado PM relativo obtenido
Buffer diluído 1 señal correspondiente a 200000 Daltons
Cloruro de guanidinio (GuHCl) 6M 1 señal de 100000 Da
GuHCl 6M +2-mercaptoetanol 100 mM 2 señales de 75000 y 25000 Da

El GuHCl es un agente caotrópico como la urea.
El mercaptoetanol es un agente reductor de puentes disulfuro, al igual que el ditiotreitol.

¿Qué puede decir sobre la estructura cuaternaria de esta proteína?

5. Se realizó una electroforesis en un gel de poliacrilamida a pH 8.0 y en presencia de SDS, para determinar el peso molecular (PM) de...