Citricos

Agrociencia
Colegio de Postgraduados
agrocien@colpos.colpos.mx

ISSN (Versión impresa): 1405-3195
MÉXICO

2007
Isidro H. Almeyda León / Mario A. Rocha Peña / M. Magdalena Iracheta Cárdenas /
Fermín Orona Castro / Craig J. Kahlke
MÉTODO SIMPLE PARA LA DETECCIÓN MÚLTIPLE DE VIROIDES DE CÍTRICOS
Agrociencia, enero-febrero, año/vol. 41, número 001
Colegio de Postgraduados
Texcoco,México
pp. 87-93

Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Universidad Autónoma del Estado de México
http://redalyc.uaemex.mx

MÉTODO SIMPLE PARA LA DETECCIÓN MÚLTIPLE DE
VIROIDES DE CÍTRICOS
A SIMPLE METHOD FOR THE MULTIPLE DETECTION OF CITRUS VIROIDS
Isidro H. Almeyda-León1, Mario A. Rocha-Peña1, M. Magdalena Iracheta-Cárdenas1, Fermín Orona-Castro1,Craig J. Kahlke2
1
INIFAP/UANL. Unidad de Investigación en Biología Celular y Molecular. Apartado Postal 128-F.
Ciudad Universitaria. 66450. San Nicolás de los Garza, Nuevo León. (rocha.mario@inifap.gob.mx;
mrocha@fcb.uanl.mx). 2Texas A&M University. Citrus Center. 312 N. International Blvd. Weslaco,
Texas 78596. USA.

RESUMEN

ABSTRACT

La detección de viroides mediante RT-PCR en Méxicoes de uso
común en los laboratorios de acreditación para determinar la
calidad sanitaria de plantas de cítricos, cuando se van a utilizar
árboles madre para propagar plantas de vivero. En el presente
trabajo se describe una metodología simple para la detección
múltiple de los viroides Citrus exocortis viroid (CEVd), CVd II, y
Citrus viroid III (CVd III) en una sola reacción de RT-PCR. Laextracción de ácidos nucleicos se efectuó con cantidades mínimas
(250 mg) de tejido, y adicionando 1% polivinilpirrolidona en la
solución salina de extracción de glicina-fosfato. La detección de
los tres viroides fue exitosa cuando las reacciones de RT se efectuaron con 2.0 µg de ARN, 1.0-1.5 mM de dNTP’s, 0.90 µM, del
iniciador complementario (C) para CEVd, y 0.49 µ M para loscorrespondientes iniciadores C para CVd II y CVd III, respectivamente, seguidas por reacciones de PCR con 2-4 µ L de cADN
procedente de RT y 10, 5, 5 pmoles del juego de iniciadores
homólogos (H) y C para CEVd, CVd II y CVd III. Al usar menos
de 1.0 µM de dNTP’s, así como cantidades iguales de los iniciadores C en las reacciones de RT y cantidades iguales del juego de
iniciadores C y H para CEVd and CVd IIy CVd III en las
reacciones de PCR, proporcionaron detección simultánea confiable
para CVd II y CVd III, pero resultados erráticos con CEVd.

RT-PCR for viroid detection is commonly used by certified
laboratories in México to determine sanitary quality of citrus
plants, when donor trees are to be used to propagate plants in
nursery. This paper describes a simple methodology for multipledetection of the viroids Citrus exocortis viroid (CEVd), CVd II
and Citrus viroid III (CVdIII) in a single RT-PCR reaction.
Nucleic acids were extracted with minimum quantities of tissue
(250 mg) and 1% polyvinylpyrrodolidone was added to a saline
extraction solution of glycine-phosphate. Detection of the three
viroids was successful when the RT reactions were performed
with 2.0 µ g of RNA,1.0-1.5 mM of dNTPs, 0.90 µ M of the
complementary primer (C) for CEVd, and 0.49 µ M for the
corresponding C primers for CVd II and CVd III, respectively,
followed by PCR reactions with 2-4 µL of cDNA from RT and
10, 5, 5 pmols of the set of homologous (H) and C set of primers
for CEVd, CVd II and CVd III. The use of less than 1.0 µ M of
dNTPs and equal quantities of the C primers in theRT reactions
and equal quantities of both C and H primers for CEVd and
CVd II and CVd III in the PCR reactions provided reliable
simultaneous detection for CVd II and CVd III, but erratic results
with CEVd.
Key words: Citrus cachexia, citrus exocortis, nucleic acid extraction,
polyvinylpyrrolidon.

Palabras clave: Citrus cachexia, citrus exocortis, extracción de ácidos nucleicos,...