CLONACI N DE UN FRAGMENTO DE DNA

CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA:

La preparación del DNA va a depender del organismo del que proceda.
El DNA podrá  obtenerse mediante la extracción a partir de la célula, generalmente con la finalidad de construir una genoteca.
  Básicamente consiste en una lisis celular y la purificación del DNA, con la finalidad de que este resulte libre de contaminantes.  La lisis puede conseguirse mediantemétodos físicos y químicos.
  La pared bacteriana se degrada mediante un lisozima y se lisa con EDTA y SDS.  Posteriormente las proteínas y el RNA  se  degradan  por tratamiento con proteasas (ej: Kinasa K)  y con RNAasas.  El DNA se podrá separar de los enzimas y los restos ya que precipitará con etanol.
  Este DNA purificado, en el que está representado todo el genoma del individuo lo vamos afragmentar con el objetivo de construir lo que denominamos genotecas.
Antes por tanto tendremos que fragmentar el DNA.

 
 FRAGMENTACIÓN DEL DNA, ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. 
 
 Las endonucleasas de restricción son enzimas que se encuentran en numerosas especies bacterianas y su función es la de reconocer y cortar el DNA foráneo.  El DNA de la propia célula no se corta y esto es porque la la secuenciaque reconocería el enzima se encuentra metilada y por tanto no podrá actuar. El conjunto formado por la metilasa y la endonucleasa es lo que se denomina sistema de modificación- restricción. Aunque los enzimas varían en algunos aspectos de sus condiciones de actuación, se ha observado que todos ellos requieren Mg y actúan a un Ph óptimo de entre 7.2 y 7.8. 
Existen tres tipos de endonucleasas, queidentificamos con la abreviatura de tres letras correspondientes a la especie bacteriana de la que proceden.
Las del Tipo I cortan de forma inespecífica en un punto que dista de la secuencia de reconocimiento alrededor de 1000 pares de bases.
Las de Tipo III, aunque también es bastante inespecífica, corta en un punto más cercano de la secuencia que las del tipo I, a unos 25pb.
Tanto la una comola otra requieren energía a partir de ATP.
Las endonucleasas de tipo II son las más utilizadas.  No requieren ATP y cortan específicamente en la secuencia de reconocimiento.
  Estas secuencias del DNA de doble hebra tienen entre 7/9 pb y son secuencias palindrómicas o invertidas.  Aunque estas secuencias son específicas algunas endonucleasas reconocen secuencias incluidas en secuencias dereconocimiento de otros enzimas.  Por ejemplo, la Sau 3 AI reconoce la secuencia GGATCC, la cual está incluida en la secuencia de reconocimiento de la Bam HI, GGATCC.  Los extremos resultantes serán por tanto compatibles. En el caso de que ambas enzimas reconozcan la misma secuencia, estos enzimas se denominarán isoesquizómeros.  Estos pueden cortar en distintos puntos de la secuencia o puedendiferenciarse en que uno de ellos es sensible  y el otro no a las metilaciones.

A su vez, los fragmentos obtenidos podrán ser extremos romos, si cortan ambas cadenas en el centro de la secuencia, o cohesivos, si cortan enlaces separados unos pocos nucleótidos en cada cadena complementearia.
Una vez que se ha fragmentado el DNA, podemos separar el fragmento que nos interesa mediante una electroforesis en gelde agarosa.  Sin embargo debido a la digestión obtendremos numerosos fragmentos de distintos tamaños donde también influirá el tiempo que hemos dejado al enzima para que actúe.  Por ello es mucho más práctico construir, antes de clonar nuestro fragmento, una librería de DNA.
Por último decir que en la actualidad, mediante programas de ordenador podemos situar todos los posibles puntos de corte deenzimas de restricción, obteniendo así lo que se denomina mapa de restricción.
 
 GENOTECAS
 
Una librería de DNA es una colección de los fragmentos derivados del genoma de un organismo.
El paso previo va a ser la purificación y la digestión parcial del DNA mediante los métodos descritos.  Una vez fragmentado lo sometemos a un proceso de separación como por ejemplo utilizando una centrifugación...