COLORIMETR A Practica 4

COLORIMETRÍA. LEY DE LAMBERT-BEER
Objetivo:
Adquirir los conocimientos básicos sobre espectrofotometría de absorción visible, incluyendo la Ley de Lambert-Beer y sus aplicaciones en Química. Para ello se realizará un experimento en el laboratorio que muestre cómo utilizar un espectrofotómetro para llevar a cabo la determinación cuantitativa de un compuesto
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Introducción:
La colorimetría es unade las técnicas empleadas con mayor asiduidad en los laboratorios de Bioquímica. Esta técnica suministra información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolución. El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz paralela monocromática a través de una muestra líquida y medir la intensidad del haz luminoso emergente. La fracción de luz incidente absorbida por unasolución a una longitud de onda está relacionada con el paso óptico y con la concentración de la especie absorbente. Estas dos relaciones están combinadas en la ley de Lambert-Beer:
Log Io / I = ∈ c l
En donde Io e I son las intensidades de la luz incidente y emergente respectivamente, l el paso óptico de la muestra absorbente (cm), c la concentración de la especie absorbente (moles/litro) y ∈ elcoeficiente de absorción molar (M-1 cm -1). La expresión log Io / I se denomina absorbancia y se designa por A (siendo adimensional). Fijando el paso óptico (habitualmente 1 cm), resulta que la absorbancia A es directamente proporcional a la concentración del soluto absorbente. El coeficiente de absorción molar varía con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente, la longitud de onda ytambién con el pH.
La aplicación obvia de la ley de Lambert-Beer es el uso del colorímetro para determinar la concentración de una gran variedad de moléculas que absorben luz (p. ej. Carotenos, clorofila, hemoglobina, etc.). La técnica se extiende a sustancias no coloreadas como azúcares o aminoácidos después de alguna reacción capaz de convertir sustancias incoloras en derivados coloreados.
Losespectros de absorción, gráficos que relacionan absorbancia con longitudes de onda, son frecuentemente utilizados en Bioquímica para la caracterización e identificación de biomoléculas.
En esta práctica se realizará un sencillo análisis espectrofotométrico que consistente en la obtención del espectro de absorción y construcción de una curva patrón para verificar la ley de Lambert-Beer, calcular elcoeficiente ∈ y determinar la concentración de una muestra de concentración desconocida.
Espectrofotometría ultravioleta visible.
Ley de Lambert-Beer. Los métodos espectroscópicos de análisis están basados en la medida de la radiación electromagnética que es absorbida o emitida por una sustancia. En función de ello se clasifican fundamentalmente en:
Métodos de absorción:
: Se basan en ladisminución de la potencia de un haz de radiación electromagnética al interaccionar con una sustancia.
Métodos de emisión:
: Se basan en la radiación que emite una sustancia cuando es excitada previamente por medio de otro tipo de energía (térmica, eléctrica...).
Métodos de fluorescencia:
: Se basan en la radiación que emite la sustancia cuando es excitada previamente por un haz de radiaciónelectromagnética. Otras clasificaciones de los métodos espectroscópicos se establecen en función de la región del espectro electromagnético que interviene en la técnica. Así, pueden utilizarse regiones como rayos X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc. En la Figura 1.Pueden verse las regiones del espectro electromagnético, en función de los valores de la longitud de onda (λ) de cada radiación.Material y equipo necesario


Procedimiento:
En el manejo del espectrofotómetro han de observarse una serie de precauciones:

● No dejar huellas en las paredes de la cubeta espectrofotométrica.
● Enjuagar cuidadosamente la cubeta espectrofotométrica con la disolución que va a ser medida, antes de llenarla definitivamente.
● Realizar las medidas empezando por la disolución más diluida y...