Como contar celulas en camara de Neubauer

Recuento de células
Para mantener unas condiciones de cultivo reproducibles entre pases y experimentos, es
recomendable sembrar las células a la misma densidad (ver tabla arriba), lo cual suponela
necesidad de conocer el número de células en la suspensión preparada (ver punto anterior).
La manera más común de determinar el número de células es contando éstas en un
hemocitómetro (ver Figura1); como la tripsinización y pipeteo de las células siempre
conlleva algo de muerte celular, es conveniente teñir de alguna manera las células de forma
que se puedan contar células vivas y muertas,y el total. Para sembrar de nuevo las células,
habrá que contar, por supuesto, con el número de células vivas.
La distinción entre células vivas y muertas se lleva a cabo utilizando colorantesvitales, entre
ellos, el más usado es Azul de Tripano (Trypan Blue), cuyo stock está a una concentración del
0.4% en tampón fisiológico (pej. PBS)
Continuando con el ejemplo de la tripsinizaciónanterior, tomar 20 μl de células (que al final
se van a descartar, o sea que desde este momento no se necesita esterilidad), y mezclar en un
tubo eppendorf con 20 μl de solución de trypan blue. Pipetear10 μl de esta nueva suspensión
en cada lado del hemocitómetro. (ver Figura 1).
Bajo el microscopio, se observará que el hemocitómetro esta equipado con una cuadrícula de
9 cuadrados grandes cada unosubdividido en otros 16 más pequeños. Debido al diseño de la
cámara, el volumen de medio sobre uno de los cuadrados grandes es 0.1 μl. El recuento se
lleva a cabo sobre dos cuadrados grandes encada lado de la cámara, de manera que se tengan
cuatro determinaciones del número de células en cuadrado grande, y cuya media será el
número de células en 0.1 μl de la suspensión de células en trypanblue. (Para reducir el error
de recuento se habrá de contar tantos cuadrados como sean necesarios para al menos
acumular un mínimo de 100 células en total; por tanto, preparar una suspensión que...