Cromatografía en columna

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
La cromatografía se puede dividir de acuerdo a muchos criterios en diferentes clasificaciones. Puede ser de acuerdo a su naturaleza de la fase móvil, sin embargo es en la clasificación por técnica donde entra la cromatografía en columna.
La cromatografía en columna consiste en la aplicación de una muestra compleja de una sustancia a una columna de cristal en la que seha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Los diferentes componentes se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eludidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida, los componentes se puedenseparar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida en caso de que los componentes sean proteínas, por ejemplo.

Términos importantes en la cromatografía en columna:
* Matriz de la columna. Sustancia que está empapadade solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina el lecho de la columna.
* Longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
* Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en unacolumna cromatográfica.
* Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de lacolumna.
* 'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen de solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que contiene las proteínas no afines al ligando

Tipos de cromatografía en columna
El principio de separación de la cromatografía es laaplicación de un criterio de separación a las sustancias que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las sustancias que se quieren separar: peso molecular, carga eléctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc... En función de cuál sea el criterio de separación que se aplique se diferencian tres tipos decromatografía en columna:

Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las sustancias dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidasen la columna las sustancias que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las sustancias cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eludidas las restantes. Para eludir las sustancias retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la sustancia de interés o el de la matriz,neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las sustancias en la columna.



Cromatografía de filtración en gel
La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos moléculas de la sustancia de tamaños tales que...