Espectrofotometría

Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica I

III.

PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Práctica No. 1
ESPECTROFOTOMETRÍA
FECHA

INTRODUCCIÓN

Uno de los métodos fisicoquímicos más empleados en análisis bioquímico es el
de la medida de la absorción o emisión de energía radiante (Bender, 1992).
La energía radiante se define como la energía transmitida en forma de
radiaciónelectromagnética. La luz se comporta como onda cuando se producen los
efectos de interferencia y difracción. Cada ciclo de la onda se repite en intervalos
separados por una longitud de onda la cual determina el color de la luz. La energía
radiante puede ser absorbida, transmitida, reflejada y refractada por muchas
sustancias en diferentes estados de agregación (sólido, líquido, disolución, gas), si laradiación tiene una longitud de onda apropiada. La absorción de luz (longitud y
cantidad) pueden poner en evidencia la presencia y cantidad de un compuesto de
interés (Skoog, Holler, Jame& Nieman, 2001).
En espectrofotometría, la energía que incide sobre una muestra es una
radiación monocromática (energía radiante de una sola longitud de onda, o por
razones prácticas, una banda muy estrecha delongitudes de onda). Las medidas de la
radiación transmitida se realizan mediante aparatos muy sensibles como el
espectrofotómetro. Este consta básicamente de una fuente de radiación, un dispersor
de longitud de onda (prisma de cuarzo, vidrio o cloruro de sodio (NaCl)), una
fotocélula y un detector (fotomultiplicador) (Skoog et al., 2001).
Cuando se encuentra un sistema coloreado o un colorproducido en una
reacción, es preciso la adecuada determinación espectrofotométrica del constituyente,
para lo cual es necesario hacer una selección de la longitud de onda analítica más
apropiada para el efecto, obtener la absorbancia en nanómetros (nm) y lograr
obtener la concentración de dicho constituyente (Bender, 1992; Skoog et al., 2001).
La gran difusión de esta técnica es consecuencia de:(1) el amplio intervalo de
longitudes de onda o de frecuencias de energía radiante y sus diferentes modos de
interacción con la materia; (2) la existencia en el mercado de instrumentos de medida
cada vez más precisos; (3) las ventajas inherentes al método (Bender, 1992; Skoog et
al., 2001).

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Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica I

Determinación del espectro de absorciónSe estudia en el espectrofotómetro la disolución del constituyente que se
analiza, después de que dicho constituyente ha desarrollado color, determinándose
su espectro de absorción. La longitud de onda seleccionada normalmente es aquella
en la que la diferencia entre la absorbancia del compuesto coloreado y el reactivo
sea máxima. Aunque la longitud de onda escogida no sea muy sensible, debeser
segura(Bender, 1992).
Curva de calibración
Después de determinar la longitud de onda a la cual deben de realizarse las
medidas, se calibra el método. Para ello, se miden una serie de patrones del
constituyente estudiado. Las medidas de transmitancia (o absorbancia) se realizan
ajustando la escala de medida del espectrofotómetro a 100% de transmitancia (o cero
de absorbancia), cuando elrayo luminoso pasa a través de un blanco (como blanco
se conoce una preparación que debe tener una composición idéntica a la de la
muestra,
excepto que no debe contener al constituyente que se ha de
determinar)(Bender, 1992).
Con los datos de la transmitancia o de la absorbancia para las diferentes
concentraciones de series patrón, se construye una curva de calibración, por medio de
la cualse determinan las concentraciones de las muestras desconocidas (Bender,
1992).
El propósito de la práctica es determinar el espectro de absorción del cloruro
de cobalto a distintas concentraciones para realizar la curva de calibración y
posteriormente obtener la concentración de una muestra desconocida.
OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de:
Determinar...