Cuantificación De Proteinas En Muestras Vegetales

CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS EN MUESTRAS VEGETALES



UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS
INGENIERIA AGRONOMICA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA VEGETAL
2012
MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
* 20tubos de ensayo
* 2 pipetas de 1 y 5 ml
* Fotómetro visible
* Agitadores de tubos
* Vaso de precipitado

REACTIVOS
* Buffer fosfato 100mm PH:7.0
* Reactivo A: Na2Co3 al 2%,NaOH0.1 M
* Reactivo B1: CuSo4,5H2Oal 1%
* Reactivo B2:tartrato sódico-potasio al 2%
* Reactivo c: Se prepara ,mezclando los reactivos A,B1 y B2,en proporciones 50:0.5:0.5(en volumen)
*Reactivo Folin-Ciocalteau:reactivo comercial diluido a 1:2
* Solución patrón de albumina de suero bovino (BSA) (1mg/ml)
* Muestra vegetal

PROCEDIMIENTO

Para determinar la concentración deproteínas de la muestra problema se construye una curva patrón o de calibrado a partir de una solución patrón (BSA)(1mg/ml).la concentración que tienen las muestras problema se determina porinterpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón.
Si tubo B, que solo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del fotómetro a cero de absorbancia.

Preparaciónmuestra
a. Pesar 2 gramos de la muestra por duplicado y disolverlos en 5mL de Buffer fosfato 100mm PH:7.0
b. Agitar hasta homogenizar la muestra en un vaso de precipitación durante 10 min.c. Trasferir las suspensiones o soluciones a los tubos para centrifuga y centrifugar por 20 minutos.
d. Recolectar el sobrenadante y determinar la concentración de proteína total expresada comomiligramos de proteína por gramo de muestra.

Preparación curva de calibración
a. Marcar los tubos de ensayo de 10mL para hacer la curva de calibración con BSA.
b. Pipetear las cantidadesde agua, solución patrón de albumina y solución problema señaladas en la tabla.
c. Preparar el reactivo C, a partir de los reactivos A, B1 y B2.
d. Pipetear a todos los tubos el reactivo...